董凯强 李彦楠 代宝安 敖与天 王一帆 邢佳 郭蓉娟

抑郁症是一种以高发病率、高复发率、高致残率、高自杀率为特点,以情绪低落、快感缺失、精力降低等为主要临床表现的精神障碍类疾病,其降低了患者的生活质量并严重影响患者的社会心理功能[1]。抑郁症的病理机制十分复杂,尚未完全明确,目前一致认为抑郁症是一种多系统疾病[2-3]。近年来,抑郁症与免疫系统紊乱的之间的关系备受关注,越来越多的证据表明免疫功能的损伤与抑郁症的发生发展密不可分[4-5]。目前,中医对于抑郁症免疫系统紊乱的研究主要集中在免疫因子,而对于免疫细胞的研究较少[6]。醒脾解郁方由西洋参、石菖蒲、郁金、贯叶金丝桃四味药组成,为本课题组在王永炎院士理论指导下创制的方药。前期研究表明,该方治疗抑郁症临床疗效确切,同时可以改善抑郁大鼠的免疫功能,但其具体机制尚不明确[7-8]。因此,本研究拟采用慢性不可预见轻度应激(chronic unpredictable mild stress,CUMS)的方法建立抑郁大鼠模型,以选择性5-羟色胺再摄取抑制剂西酞普兰作为阳性对照药。探究醒脾解郁方发挥抗抑郁的作用的同时,对抑郁大鼠T细胞亚群的影响,以期揭示醒脾解郁方改善免疫功能的具体机制,为促进其进一步临床应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级SD大鼠,雄性,7～8周龄,体质量200～220 g,40只,购于斯贝福(北京)生物技术有限公司,动物生产许可证号为:SCXK(京)2019-0010。所有动物饲养于北京迈德康纳生物技术有限公司实验动物中心,动物使用许可证号为:SYXK(京)2020-0050,环境温度为20～25℃,相对湿度60%,采用明暗各12小时交替的动物照明光循环照明,动物饮用水及笼具经高压灭菌锅灭菌处理,饲料及垫料均经辐照处理,自由饮水,动物的操作参考北京市实验动物管理委员会执行,符合规定的伦理要求,伦理许可证为:MDKN-2022-025。

1.2 实验药物

醒脾解郁方颗粒由西洋参、贯叶金丝桃、石菖蒲、郁金组成,为中药免煎颗粒剂,由山东新时代药业提供;西酞普兰(MCE,HY-14258,100 mg)。

1.3 主要试剂

FoxP3(abcam,ab215206);山羊抗兔IgG H&L (abcam,ab6721);FITC anti-Rat CD45(BioLegend,202205);PE anti-Rat CD4(BioLegend,201507);APC anti-Rat CD3(BioLegend,201413);PerCP anti-Rat CD8(BioLegend,201712);异氟烷(RWD,R510-22-10)。

1.4 实验仪器

流式细胞仪(美国BD, LSRII),低速离心机(中国京立,LD5-10B),包埋机(武汉俊杰电子有限公司,型号JB-P5),病理切片机(上海徕卡仪器有限公司,型号RM2016),3D Histech(Pannoramic 250,Pannoramic MIDI,Magyarország),旷场平台(北京众实科技,ZS-KC),强迫游泳平台(北京众实科技,fxwt),Labmaze动物行为学分析软件 V3.0(北京众实科技,LabMaze),气体麻醉机(RWD,R500IE)。

1.5 模型制备与动物分组

实验前适应性喂养1周,室内温湿度恒定,通风良好,自由进食。随后实验大鼠随机分为空白对照组、模型组、西酞普兰组、醒脾解郁方组,开始造模。

采用6周CUMS方法制备抑郁模型大鼠[9]。CUMS涉及暴露于各种轻度压力源:食物剥夺24小时、饮水剥夺24小时、身体束缚3小时、笼子倾斜(45°)7小时、过夜照明、潮湿垫料24小时、4℃冷水游泳5分钟、夹尾2分钟。8种刺激随机安排到42天内,每日1种,同种刺激不连续出现,使小鼠不能预料刺激的发生。空白对照组正常饲养,未给予刺激。

1.6 药物干预

各组大鼠灌胃给药。西酞普兰组及醒脾解郁方组造模同时给药6周,灌胃药物剂量分别为西酞普兰1 mg/kg,醒脾解郁方12.5 g/kg。空白对照组、模型组给予等剂量0.9% 氯化钠溶液灌胃。

1.7 标本采集

给药结束后,每只大鼠经异氟烷气体麻醉,抗凝管进行采血,室温静置3～4小时,4 500 r/min离心15分钟,收集上清,-80℃保存备用。随后每只大鼠暴露脾脏,小心拨开脾脏组织置于培养基中备用,每组随机选取5只大鼠脾脏组织进行下一步流式检测,一部分脾脏组织使用4%多聚甲醛固定,进行病理染色。

1.8 观察指标与方法

1.8.1 大鼠抑郁样行为评价 采用糖水偏好实验、旷场实验、强迫游泳评价大鼠的抑郁样行为。(1)糖水偏好实验:适应性训练:在训练中,大鼠在前24小时每笼放入两瓶1%的蔗糖溶液,随后24小时将其中一瓶蔗糖溶液换为纯水,适应结束后,所有大鼠剥夺食物及饮水12小时。大鼠单笼饲养,每只大鼠可自由获得两个预先称重的瓶子,其中分别包含240 mL蔗糖溶液(1%)及240 mL纯水,进行6小时观察。实验结束时,将1%蔗糖溶液和纯水瓶重新称重并记录。糖水偏好的百分比差异计算公式如下:糖水偏好率(%)=蔗糖溶液消耗量/总液体(蔗糖溶液+纯水)消耗量×100%。(2)旷场实验:所有大鼠置于安静通风避光的屏障环境内,使用专用大鼠旷场平台(100 cm×100 cm×45 cm)进行实验,实验第一天为适应性训练,所有大鼠至于实验箱中央格内10分钟,每次实验完毕用酒精擦拭平台,纸巾擦干。第二天每只大鼠实验5分钟。使用Labmaze动物行为学分析软件分析大鼠的不动时间、直立次数以及穿越次数。(3)强迫游泳:实验第一天为适应性训练,所有大鼠分别24～26°C温水中游泳10分钟。实验第二天,每只大鼠相同条件下游泳5分钟,取中间3分钟记录大鼠不动时间。

1.8.2 体质量测量 标本采集前,采用电子天平分别对各组大鼠进行称重,并记录其体质量。

1.8.3 脾脏指数测定 实验结束后各组大鼠取出脾脏,剥离外部脂肪和结缔组织,用吸水纸吸去表面的血液后称取质量,计算脾脏指数,即脾脏的质量与大鼠体质量的比值。

1.8.4 HE染色观察脾组织形态学变化 取组织固定于4%多聚甲醛24小时以上,对组织进行修剪,依次进行梯度脱水,进行石蜡包埋,修整好的蜡块使用莱卡切片机进行切片,片厚4 μm,随后进行60℃烘箱内烤片,切片脱蜡至水,切片入Harris苏木素染3～8分钟,水洗两次。将切片入伊红染液中染色1～3分钟。使用95%酒精脱水两次,每次5分钟,二甲苯清洗三次,每次5分钟,中性树胶进行封片。所有切片使用3D Histech扫描仪器进行扫描,每张切片随机选取3个视野进行分析。

1.8.5 免疫组化检测脾脏Foxp3的表达情况 取修整好的蜡块使用莱卡切片机进行切片,片厚4 μm,常规脱蜡脱水。将切片至于高压锅中,加入适量修复液,计时2分钟后冷却至室温,修复完毕;采用与二抗相同来源的血清进行封闭,37℃孵育30分钟。进行一抗孵育、二抗孵育;DAPI工作液滴加到组织上,室温孵育5分钟,再用PBS洗涤3次,每次5分钟。将液体甩干,在组织上滴加封片剂,盖上盖玻片,中性树胶封片,所有切片使用3D Histech扫描仪器进行扫描,每张切片使用3D Histech截取每张切片相同200倍视野,保证每张照片的背景光一致。应用Image-ProPlus6.0软件将免疫组化中棕褐色作为判断所有照片阳性的统一标准,对每张照片进行分析得出阳性细胞数量,并计算出阳性率(阳性率=阳性细胞数量/总细胞数量×100%)。

1.8.6 流式细胞术检测脾脏以及外周血T淋巴细胞的变化 收集外周血与脾脏,混匀抗凝外周全血,将脾脏组织置于铁质滤网,均匀研磨至脾脏细胞充分脱落,用PBS将滤网上粘连的脾脏细胞进行冲洗,收集洗脱下来的脾脏细胞,随后吸取全血样本与单细胞悬液;向样本中加入CD3、CD4、CD8、CD45流式荧光标记抗体,轻轻振荡混匀,同时做好仪器补偿单染管、空白对照管以及同型对照管。室温避光反应20分钟,加入2 mL红细胞裂解液,振荡混合均匀,室温避光反应10分钟;用离心机300 g离心5分钟,弃上清;加入2 mL细胞洗液,300 g离心5分钟弃上清;加入500 μL细胞洗液,混匀后上机获取细胞分析。

1.9 统计学方法

2 结果

2.1 各组大鼠糖水偏好实验指标比较

与空白对照组相比,模型组大鼠糖水偏好率降低(P<0.05);与模型组相比,醒脾解郁方组大鼠糖水偏好率升高(P<0.05)。见表1。

表1 各组大鼠糖水偏好率比较

2.2 各组大鼠旷场实验实验指标比较

与空白对照组相比,模型组大鼠旷场实验直立次数和穿越次数均降低(P<0.05);与模型组相比,醒脾解郁方组大鼠旷场实验直立次数和穿越次数均升高(P<0.05)。见表2。

表2 各组大鼠旷场实验比较次)

2.3 各组大鼠强迫游泳实验指标比较

与空白对照组相比,模型组大鼠强迫游泳不动时间延长(P<0.05);与模型组相比,醒脾解郁方组大鼠强迫游泳不动时间缩短(P<0.05)。见表3。

表3 各组大鼠强迫游泳不动时间比较

2.4 各组大鼠体质量指标比较

与空白对照组相比,模型组大鼠体质量下降(P<0.05);与模型组相比,醒脾解郁方组大鼠体质量升高(P<0.05)。见表4。

2.5 各组大鼠脾脏指数以及脾组织形态比较

2.5.1 脾脏指数 与空白对照组相比,模型组大鼠脾脏指数降低(P<0.05);与模型组相比,醒脾解郁方组大鼠脾脏指数升高(P<0.05),见表5。

表5 各组大鼠脾脏指数比较

2.5.2 脾组织形态 与空白对照组相比,模型组大鼠出现脾组织结构中度异常,部分脾小结结构紊乱,红髓白髓界限不清。与模型组相比,醒脾解郁方组大鼠脾脏实质分布较为均匀,红髓、白髓界限较清楚,见图1。

2.6 各组大鼠脾脏Foxp3阳性率比较

与空白对照组相比,模型组大鼠脾脏Foxp3阳性率升高(P<0.05)。与模型组相比,醒脾解郁方组大鼠脾脏Foxp3阳性率降低(P<0.05),见图2、表6。

注:A 空白对照组; B 模型组; C 醒脾解郁方组; D 西酞普兰组。

表6 各组大鼠脾脏Foxp3阳性率比较

2.7 各组大鼠脾脏T淋巴细胞亚群比例比较

与空白对照组相比,模型组大鼠CD3+T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞占淋巴细胞比例降低(P<0.05)。与模型组相比较,醒脾解郁方组大鼠CD3+T细胞、CD4+T细胞比例升高(P<0.05),而CD8+T细胞比例无统计学意义(P>0.05),见表7、图3。

注:A 空白对照组;B 模型组;C 醒脾解郁方组;D 西酞普兰组。

表7 各组大鼠脾脏T淋巴细胞比例比较

2.8 各组大鼠外周血T淋巴细胞亚群比例比较

与空白对照组相比较,模型组大鼠CD3+T细胞、CD4+T细胞占淋巴细胞比例降低(P<0.05)。与模型组相比,醒脾解郁方组大鼠CD3+T细胞、CD4+T细胞占淋巴细胞比例显著升高(P<0.05)。各组CD8+T细胞占淋巴细胞比例均无统计学意义(P>0.05)。见表8、图4。

注:A 空白对照组;B 模型组;C 醒脾解郁方组;D 西酞普兰组。

表8 各组大鼠外周血T淋巴细胞比例比较

3 讨论

抑郁症属于中医学中“郁病”“百合病”的范畴[10]。醒脾解郁方是本课题组在王永炎院士“虚气流滞”理论指导下创制的方药,由西洋参、石菖蒲、郁金、贯叶金丝桃等药组成。方中君药西洋参味甘、性凉,可益气养阴、清热生津;臣药石菖蒲味辛、性温,可化湿豁痰、健脾宁神;郁金、贯叶金丝桃味辛、气寒,可行气解郁、清心凉血、清热利湿共为佐药。全方兼顾虚实,气血并调,组方以清补元气为主,泻火解郁为辅,兼顾宁神、利湿、化痰之功效,临床疗效确切,并已申请专利(201510047421.4)[11]。

本研究结果显示, 醒脾解郁方具有抗抑郁作用, 主要表现为显著改善抑郁模型大鼠的抑郁样行为,如减少强迫游泳不动时间,增加糖水偏好率、旷场实验穿越以及直立次数等。并且该方可以改善脾脏结构、降低Foxp3的表达以及改变脾脏以及外周血T细胞亚群的比例,使受损的免疫功能趋于正常。

抑郁症与免疫之间的关系被很多研究证实,然而研究结果并不完全一致[12]。近期发现的脑—脾轴可由神经信号传递对免疫应答进行调控,与抑郁症密切相关,并且神经炎症可能是通过脑—脾轴引起抑郁症;同时脾脏是人体外周免疫系统中最大的免疫器官,是T淋巴细胞重要的产生和储存场所,其结构的稳定可以促进T细胞的发育和活化,以发挥正常的免疫功能,二者均表明脾脏与抑郁症密切相关[13-14]。本研究结果显示,与模型组大鼠相比较,醒脾解郁方能显著增加脾脏指数,改善脾脏形态学结构,并减轻炎性浸润,这与先前的一项研究结果一致[15],但与另一项研究结果不一致,该研究表明切除脾脏后的小鼠与正常小鼠的行为并无明显差异,这表明脾脏对于抑郁症发生发展可能具有双向调节性[16]。

T淋巴细胞介导的特异性免疫反应是免疫功能的核心,T淋巴细胞亚群动态平衡是免疫系统稳定的重要保障[17]。T细胞依据功能不同可以分为辅助性T细胞、细胞毒性T细胞以及调节性T细胞。辅助性T细胞(Th细胞)又称为CD4+T细胞,能够激活和调节其他免疫细胞的活性,发挥免疫功能,并且对于维持神经发生也至关重要[18];CD8+T细胞在抗原刺激后分化为细胞毒性T细胞(CTL细胞)发挥作用,这种T细胞能够识别靶细胞,并通过分泌细胞毒性物质杀死靶细胞或直接诱导靶细胞凋亡[19]。转录因子Foxp3是调节性T细胞(Treg细胞)的标志性分子,是控制Treg细胞发育和功能的关键转录因子之一,而Treg细胞可以通过细胞间接触或分泌抑制性细胞因子,抑制其他淋巴细胞的活性,对机体的免疫反应起到负性调节作用,因此Foxp3在调节机体自身免疫平衡中起关键作用[20-22]。本研究结果显示,与模型组大鼠相比较,醒脾解郁方能提高脾脏及外周血中CD3+T细胞、CD4+T细胞比例,同时能降低脾脏Foxp3因子的表达,这可能意味着脾脏Treg细胞的减少,而对于CD8+T细胞的影响并不明显,这与先前的一项研究一致[23-24]。

综上所述,醒脾解郁方可以改善抑郁模型大鼠的抑郁样行为,其机制可能与改变T细胞亚群,调节紊乱的免疫系统,恢复相应的免疫功能有关。本研究为醒脾解郁方进一步应用于抑郁症的临床治疗提供实验依据,而本方为中药复方,成分相对复杂,其改善免疫功能的药理成分值得进一步探究。