鲁嘉欣

慢性萎缩性胃炎(Chronic atrophic gastritis,CAG)是一种由多致病因素引起的消化系统慢性疾病,以胃黏膜上皮和腺体萎缩,数目减少,胃黏膜变薄,黏膜基层增厚,或伴有肠上皮化生,或有不典型增生为特征[1]。目前现代医学采用根除幽门螺杆菌以及服用促动力药、抑酸药、胃黏膜保护剂、叶酸及维生素B12等作为主要治疗手段,但这些疗法对其症状的缓解及阻止黏膜病变进展的效果并不理想[2]。

升阳益胃汤出自《内外伤辨惑论》,此汤主治脾胃气虚,清阳不升,湿郁生热之证。周迎春教授应用此方,紧抓 “脾胃虚弱,阳气不升,湿热中阻”的核心病机,并概括其用药指征为“乏倦纳差口干苦,腹胀便溏或 便黏,舌淡胖大有齿痕,苔白黄腻并脉滑”,用于治疗慢性胃炎等疾病[3]。有研究认为CAG患者临床辨证分型以脾胃虚弱证型较多,在升阳益胃汤治疗慢性萎缩性胃炎脾胃虚弱证的疗效观察中发现,升阳益胃汤能有效改善临床症状,提高临床疗效[4]。然而,目前关于升阳益胃汤治疗慢性萎缩性胃炎的临床疗效观察较少涉及药理学研究,其潜在靶点及药理学作用机制进一步研究。

本研究以升阳益胃汤为基础,基于网络药理学理论,初步探讨升阳益胃汤治疗慢性萎缩性胃炎的作用机制,构建了药物的活性成分、药物靶点与慢性萎缩性胃炎相关疾病基因之间的相互作用网络,打破既往的药物“单一成分、单一靶点、单一疾病”理念,为升阳益胃汤治疗慢性萎缩性胃炎的临床治疗和相关科学研究提供支持。

1 材料和方法

1.1 升阳益胃汤中药活性成分筛选 靶点预测通过TCMSP和Herb数据库对黄芪、半夏、人参、炙甘草、独活、防风、白芍、羌活、陈皮、茯苓、柴胡、泽泻、白术、黄连进行活性成分的收集。以化合物口服生物利用度(OB,%)≥30%,类药性(DL)≥0.18作为筛选条件并且将无靶点的成分筛选掉。

1.2 慢性萎缩性胃炎相关靶点的获取通过在GeneCards、OMIM、DisGent数据库中输入关键词“Chronic atrophic gastritis”进行检索,以“Relevance score”大于等于1作为标准进行筛选,最终从而得到慢性萎缩性胃炎相关靶点。

1.3 药物-疾病靶点预测结果将获得的药物作用靶点与慢性萎缩性胃炎靶点作韦恩图,从而获得交集基因。然后使用Cytoscape 3.8.2软件构建“化合物-作用靶点”网络,根据化合物与靶点的连接情况筛选出药物作用于慢性萎缩性胃炎的关键化合物。

1.4 靶蛋白相互作用及核心靶点筛选为了进一步研究药物治疗慢性萎缩性胃炎的蛋白之间的相互作用,将药物-交集基因上传至相互作用数据库String进行蛋白相互作用网络构建(PPI)数据库;运用Cytoscape挑选核心的靶点做出蛋白相互作用网络图。

1.5 GO富集分析和KEGG通路分析将药物-疾病交集基因进行GO、KEGG功能富集分析,利用微生信平台GO基因功能从生物过程、细胞成分、分子功能三方面注释药物治疗慢性萎缩性胃炎的作用靶蛋白在基因功能中的作用。为阐明药物治疗慢性萎缩性胃炎的靶点在信号通路中进行KEGG通路富集分析。选取GO功能条目和KEGG通路条目(P<0.05)作为药物治疗慢性萎缩性胃炎的主要基因功能富集过程和信号通路,预测中药治疗慢性萎缩性胃炎的作用机制。

1.6 分子对接将拓扑学参数排名靠前的大分子和小分子进行分子对接。使用AutodockTools1,2对蛋白质晶体结构进行去水、加氢操作,并进行受体结构准备工作。使用Open Babel及Autodock 程序对小分子库进行拆分等准备工作。对接使用Autodock程序进行,最终将结果导入pymol进行对接结果的可视化。

2 结果

2.1 升阳益胃汤活性成分筛选及靶点预测通过TCMSP和Herb数据库检索并筛选,最终共得到黄芪16个、半夏11个、人参17个、炙甘草62个、独活6个、防风17个、白芍7个、羌活12个、陈皮5个、茯苓6个、柴胡11个、泽泻5个、白术4个、黄连11个,共得到279个有效靶点。

2.2 慢性萎缩性胃炎相关靶点通过在GeneCards、DisGent、DisGent数据库检索慢性萎缩性胃炎相关的靶点,合并去重后共获得841个靶点。

2.3 药物-疾病靶点预测结果利用韦恩图得到药物-疾病交集基因102个,将上述所得的活性成分和有效交集靶点数据导入到 Cytoscape 3.8 进行网络构建,获得疾病-成分-靶点网络。对疾病-成分-靶点网络进行分析,各成分degree 值信息见图1。其中自由度前五的活性成分分别为quercetin、kaempferol、7-O-methylisomucronulatol、formononetin、naringenin,推测可能是复方的重要成分。见图1。

图1 核心成分拓扑学参数

图2 核心靶点度值

2.4 核心靶点及网络相互作用将共有靶点导入String数据库,构建PPI网络,该网络共有82个结点和252条边。为进一步得到核心蛋白,再次将共有靶点导入String平台,所得网络进行可视化处理,进一步筛选核心靶点,最终得到升阳益胃汤治疗慢性萎缩性胃炎的核心靶点共10个,分别为AKT1、TP53、IL6、TNF、JUN、VEGFA、IL1B、CASP3、PTGS2、STAT3。

2.5 生物功能富集分析

2.5.1 GO富集分析利用R软件进行GO基因功能富集分析,共筛选出多条GO条目,其中生物过程(BP)相关的有3846条,细胞成分(CC)相关的242条,分子功能(MF)相关的350条。

2.5.2 KEGG通路富集分析利用R软件进行KEGG通路富集分析,共富集到233条与药物治疗慢性萎缩性胃炎相关的通路,根据P<0.05筛选出药物治疗慢性萎缩性胃炎相关的通路,分别是:糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、IL-17信号通路、乙型肝炎信号通路、膀胱癌症信号通路、TNF信号通路、Th17细胞分化信号通路等。

2.6 分子对接分子对接结合热能<-1 kcal·mol-1表示具有结合活性,<-5 kcal·mol-1表示结合活性较好。因此,由AutodockTools1.5.6软件分子对接结果可知:拓扑学参数靠前的中药化合物小分子quercetin、kaempferol与PPI核心蛋白拓扑学参数前10的大分子受体均具有良好的结合活性。其中quercetin、kaempferol与AKT1、TNF的结合热能较低,结合活性较好。见表1。

表1 结合能表

3 讨论

通过网络药理学分析发现quercetin、kaempferol、7-O-methylisomucronulatol、formononetin、naringenin是本次研究中的重要成分。naringenin是一种具有多重结构的生物碱成分,研究发现其活性成分的提取物与慢性萎缩性胃炎发作密切相关,是治疗慢性萎缩性胃炎药物的重要载体,其主要作用机制可能和免疫调节有关,有待更多动物研究佐证[5]。体内和体外研究表明,含类黄酮和不含类黄酮的植物都有可能降低慢性萎缩性胃炎的发病率,在本研究中,山奈酚作为黄酮类物质,被认为具有潜在的抗慢性萎缩性胃炎能力,这可能和其具有抗慢性萎缩性胃炎的植物成分有关[6]。山奈酚同时具有抗利尿和抗心律失常的潜力,可以对抗各种感染类疾病[7]。研究发现,慢性萎缩性胃炎的发作过程和氧化还原反应密切相关,这可能和神经细胞发生改变有关,以氧化应激为靶点的临床药物,可明显减少慢性萎缩性胃炎患者的发作频率[8]。在众多的抗慢性萎缩性胃炎药物研究中发现,黄酮类物质可以通过调节氧化还原反应来发挥治疗慢性萎缩性胃炎的作用。研究发现,氧化应激反应会产生应激损伤,而黄酮类物质会清除损伤产生的自由基从而发挥治疗疾病的作用[9]。山柰酚可以明显改善患者的氧化应激损伤,降低患者的氧化应激水平[10]。同时,黄酮类物质可以与治疗药物中的结合位点相结合,与药物共同发挥治疗疾病的作用,保护大脑免受氧化应激的伤害。研究发现,炎症反应在慢性萎缩性胃炎的发生发展中扮演着重要的角色[11]。formononetin被认为与炎症反应密切相关,能够通过平衡 GABA-A 受体,降低丙二醛和TNF-α水平,升高谷胱甘肽、超氧化物歧化酶和过氧化氢水平,影响神经炎症从而发挥抗慢性萎缩性胃炎的作用[12]。

成分-靶点网络及PPI网络综合分析的结果显示,AKT1、TP53、IL6、TNF、JUN等靶点可能是升阳益胃汤治疗慢性萎缩性胃炎的核心作用靶点。研究发现,AKT1、IL6、TNF等炎症因子通过参与炎症反应干预慢性萎缩性胃炎进程,是重要的胃炎调控蛋白,其可能是通过多种炎症通路来发挥作用[13]。GO富集分析结果表明,升阳益胃汤治疗慢性萎缩性胃炎靶点的功能主要体现在对氧化应激反应、细胞对化学应激的反应、活性氧代谢过程、细胞对氧化应激的反应、对脂多糖的反应、对细菌来源分子的反应、对活性氧的反应、对金属离子的响应;细胞成分(CC)相关的有242条,涉及膜筏、膜微区、膜区、质膜筏、小窝、突触前膜的组成部分、突触前膜的内在成分等;其中分子功能(MF)相关的有350条,涉及碳酸盐脱水酶活性、药物结合、水解酶活性等。主要涉及的通路有AGE-RAGE信号通路、IL-17信号通路、乙型肝炎信号通路、膀胱癌症信号通路、TNF信号通路、Th17细胞分化信号通路等。研究证实,免疫、炎症、氧化还原、离子转运与细胞凋亡和慢性萎缩性胃炎发生发展密切相关[14],促炎性信号通路IL-17信号通路、TNF信号通路与自身免疫系统炎症密切相关,信号通路被激活后立刻参与自身炎症反应,这可能和相关有效因子被激活有关,调控相关信号通路,可以调控慢性萎缩性胃炎的“神经免疫性炎症”过程[15]。

综上,基于网络药理学方法对升阳益胃汤治疗慢性萎缩性胃炎作用机制进行挖掘并分析后表明,升阳益胃汤的活性成分quercetin、kaempferol、7-O-methylisomucronulatol、formononetin、naringenin等可通过AKT1、TP53、IL6、TNF、JUN等靶蛋白介导AGE-RAGE信号通路、IL-17信号通路、乙型肝炎信号通路、膀胱癌症信号通路、TNF信号通路、Th17细胞分化信号通路发挥抗慢性萎缩性胃炎作用。阐明了升阳益胃汤干预调控治疗慢性萎缩性胃炎的分子作用机制,既体现了中药治疗慢性病多途径,多靶点,多通路的治疗方式,也验证了中医学的整体医学观,为后期临床研究提供了理论支持。