刘曦，龚黎燕

基于急慢性疼痛的动物模型研究进展

刘曦，龚黎燕

浙江省肿瘤医院疼痛康复科，浙江杭州 310022

疼痛管理是临床医学的重点研究内容之一。目前，急慢性疼痛的机制尚未完全明确。为更深入地开展基础研究，需建立更多且更有针对性的动物模型以模拟各类型疼痛。本文就近年来在疼痛基础研究中常用的部分急慢性疼痛模型研究进展作一综述，为进一步研究疼痛机制及筛选相关治疗药物提供理论参考。

动物模型；吗啡耐受；急性疼痛；慢性疼痛；癌性疼痛

疼痛被列为现代医学第五大生命体征，疼痛管理是临床关注的重点之一。按损伤持续的时间，疼痛可分为急性疼痛和慢性疼痛。《癌症疼痛诊疗规范（2018版）》[1]对疼痛的定义：持续时间超过1个月的疼痛为慢性疼痛，新近产生、持续时间较短的疼痛为急性疼痛。动物模型广泛应用于疼痛的相关研究中，主要应用于疼痛机制的研究及镇痛药物效能的评估中。本文就近年来在疼痛基础研究中常用的部分急慢性疼痛模型研究进展作一综述，为进一步研究疼痛机制及筛选相关治疗药物提供理论参考。

1 急性疼痛模型

根据疼痛的发生原理，急性疼痛可分为生理性和病理性。生理性疼痛是指增加的局部刺激使机体产生的反应性疼痛；病理性疼痛是由创伤或疾病状态带来的炎症反应或神经损伤引起的，若迁延不愈可发展为慢性疼痛。目前更常见的分类方法是根据所模拟疾病的病理生理特点，将急性疼痛模型分为躯体痛模型和内脏痛模型两类。

研究认为，躯体痛可通过福尔马林模型进行模拟[2]。将1%的福尔马林液注射至实验鼠右后爪背侧，其可出现两个不同时相的疼痛反应。第一时相为注射后立刻出现的疼痛，持续时间约为10min；第二时相则从注射15～20min后开始，持续时间约为1h。在实验研究中，常使用第二时相。两时相疼痛的发生机制不同，如非甾体类镇痛药可减轻第二时相疼痛，但无法控制第一时相疼痛。大鼠和小鼠对福尔马林注射的反应也有所不同：大鼠表现为爪趾抽缩，小鼠表现为舔舐。目前认为第二时相疼痛是周围炎症性疼痛，与中枢敏化作用相关，该模型可用于因组织损伤造成的痛觉过敏机制的探索。

内脏痛动物模型主要通过炎性刺激触发并建立。例如，扭体试验是将刺激性化学物质注入实验动物体腔内，从而引发炎性疼痛[3]。将乙酸、缓激肽等试剂注入动物腹腔，观察动物随之表现出的臀部位置不正、腹部收缩等扭体反应，动物体位的改变幅度或收缩动作频率数据可用于量化评估。该方法可制备相应急性膀胱炎模型、溃疡性结肠炎模型等。福尔马林也可用于经典急性内脏痛模型的构建，向大鼠结肠壁注射1.5%的福尔马林，15min后大鼠会出现舔舐、身体收缩、扭头等动作，从而证实建模成功。

2 疼痛行为学检测

疼痛行为学检测是对实验动物施加急性、伤害性刺激，通过动物缩足或甩尾潜伏期、机械性刺激或温度刺激阈值等反射行为学变化，评估动物是否出现触诱发痛、机械性痛敏及冷热刺激反应。该类操作模拟生理性急性疼痛，无法使实验动物产生病理改变，因此不能单独用于模型制作，但常被用于各类疼痛动物模型中痛阈变化的验证。

机械性痛觉反应检测通常采用Von Frey试验[4]。该试验方法最早于19世纪由Maximilian Von Frey提出。利用Von Frey纤维丝弯曲产生既定压力，按压力的小大顺序刺激实验动物脚底并记录其机械缩足阈值；或以恒定压力的Von Frey纤维丝以恒定的频率反复刺激，测试实验动物后腿收缩频率，即机械缩足持续时间。其中，机械缩足阈值的测定标准后由Dixon和Chaplan等进一步优化[5-6]。目前，该方法已逐渐被更加便捷、精准的Von Frey电子仪所取代，以保证纤维丝连续、均匀施力。

经大鼠肛门插入可扩张的气囊，通过注气扩张结直肠可模拟内脏痛，评估动物的诱发痛行为。痛阈可通过腹壁撤回反射评分进行评价。该实验评估标准为大鼠的行为模式改变程度，实验结果主观性较强。

冷热刺激反应是啮齿类动物疼痛评估的常用方法。甩尾实验是基于实验鼠对热刺激回避反应的潜伏期进行测量的实验[7]。其操作方式为对实验鼠尾部施加热刺激，记录实验鼠尾巴甩动时间。相比于甩尾实验，热板实验的优点在于不用约束实验鼠，从而减少因人为干扰可能形成应激导致的疼痛。哈格里夫斯试验通过小鼠后爪移开某一热刺激所需的时间评估研究对象的疼痛反应[8]。

将甩尾实验中的远端热水浴替换为冰水混合物即可用于检测冷阈值，即冷刺激反应。丙酮实验通过将丙酮滴到实验大鼠后肢局部造成冷刺激，这种刺激不会让正常大鼠感到疼痛，但存在冷触觉过敏大鼠则会有疼痛反应[9]。因正常小鼠对丙酮相当敏感，易产生疼痛反应，故小鼠不适合丙酮实验；丙酮滴导致的抬足反应可能是由于冷刺激，也可能是由于化学刺激，甚至是丙酮滴的机械刺激。目前，冷平板实验多使用半导体制冷平板，适用于冷刺激痛及冷痛觉过敏的神经生物学机制和药物疗效研究。相较于丙酮实验，冷平板实验受环境温度和实验动物体温影响较小，但无法避免机械刺激的影响是其劣势[10]。

上述经典检测方式的局限性在于所检测到的反应仅为健康实验动物接受急性伤害性刺激后的变化，且因重复测试，动物可能会学习到行为反应，从而导致实验数据不够准确[11]。

3 慢性疼痛模型

慢性疼痛即病理性疼痛，其机制较急性疼痛更为复杂。根据成因，其可分为神经性疼痛、炎症性疼痛和癌性疼痛，涉及机体的系统性病变，其特点为自发性疼痛、痛觉过敏和感觉异常[12]。神经病理痛模型、慢性炎症疼痛模型及骨癌痛模型、吗啡耐受癌性疼痛模型等均是目前研究的热点模型。

3.1 慢性非癌性疼痛动物模型

使用炎性物质在实验动物皮下、关节腔注射或通过机械、热损伤组织，可在啮齿动物中诱发炎症损伤，从而构建慢性炎症疼痛模型。与急性期疼痛模型不同，为确保疼痛持续时间及相关炎性机制的触发，需使用效用更长的化学试剂，最常用的是福氏佐剂足底内注射，或肌内、关节腔注射[13]。这是一种包含灭活丁酸分歧杆菌的油包水乳剂，易于诱发浓度依赖性损伤，产生的炎性疼痛反应可持续2周，且有延长的超敏反应期，可用于构建慢性骨关节炎疼痛模型。类似的佐剂性关节炎也可通过四甲基十五烷、角叉菜胶、蛋白多糖等诱发[14]。

神经病理性疼痛模型是慢性疼痛研究中的另一种经典动物模型。最早的神经痛模型是坐骨神经慢性压扎模型，用羊肠线轻度结扎大鼠坐骨神经干，在术后3～5d引发疼痛反应，并在5～7d左右达峰，可持续2个月以上[15]。该模型可进一步优化为脊神经结扎模型和保留性神经损伤模型，分别为结扎切断L5脊神经、结扎切断胫神经和腓总神经，可避免坐骨神经慢性压扎模型中受羊肠线松紧度影响疼痛强度，甚至影响肢体运动的情况；且保留性神经损伤模型下大鼠对机械刺激更加敏感[16]。另外，可将炎性疼痛与神经病理痛结合，在坐骨神经周围直接置管注入促炎分子酶原，制备坐骨神经痛模型。

临床上较为棘手的烧伤痛是一种由炎症性疼痛、痛觉性疼痛和神经性疼痛复合而成的特殊疼痛类型，可通过综合上述疼痛模型进行模拟，也可将小鼠置于中间流有热水的空心金属板上，控制烧伤厚度制备符合需求的烧伤疼痛模型[17]。此外还存在一些较为特殊的慢性神经病理疼痛模型，如用于研究化疗药物致周围神经病理性疼痛的模型[16]。为制备该模型，Slivicki团队向小鼠腹腔内每隔1d注射1次紫杉醇，用于引发小鼠对机械刺激和冷刺激的痛觉超敏。

3.2 慢性癌性疼痛动物模型

癌性疼痛发生于60%～80%的晚期恶性肿瘤中，其危害性极大，是目前疼痛康复领域研究热点之一[1]。研究发现癌性疼痛属慢性疼痛，与非癌性疼痛的机制不同，尤其慢性癌性疼痛刺激下的大鼠脊髓小胶质细胞活性明显与非癌性不同[18]。因而用于研究癌性疼痛的动物模型与非癌性也有所区别。

癌症引起的骨痛多见于晚期恶性肿瘤的骨转移中，以机械触发痛和痛觉敏化为特征，但其机制目前尚不明确。小鼠骨癌痛模型于1999年被首次提出[19]。早期的骨癌痛模型集中于原发性骨癌痛的还原，所选细胞为可诱发骨肉瘤生长的纤维肉瘤。但事实上，乳腺癌与前列腺癌较多发生骨转移，激发骨癌性疼痛的现象更加常见。Medhurst将含MRMT细胞的Hank’s液注射到大鼠胫骨骨髓腔内，成功制备大鼠乳腺癌细胞诱导的骨癌痛模型[20]。使用Walker256大鼠腹水癌细胞对该模型进一步完善，形成简单、实用的骨癌痛大鼠模型[21]。与小鼠模型相比，大鼠体质量大，肿瘤细胞数量上的可控范围更大；同时大鼠骨骼粗，造模实验操作更方便。早年研究者大多用小鼠造模的主要原因是肿瘤细胞的细胞系多来源于小鼠。

以吗啡为代表的阿片类药物是世界卫生组织推荐的重度癌性疼痛的标准用药[1]。吗啡耐受会严重影响其镇痛效果，易发展成为难治性疼痛，改善吗啡的耐受性是癌性疼痛治疗中亟待解决的问题。吗啡耐受属药理学概念，是指重复应用吗啡后，机体对吗啡的反应性降低，导致镇痛效力降低，药效-剂量曲线右移[22]。临床表现为持续给予吗啡后镇痛效果逐渐减弱甚至消失，需增加剂量才能获得同等镇痛效果。以吗啡为代表的阿片类药物的耐受机制至今未完全明确。在基础医学领域，各类炎症细胞因子，尤其是与炎症发展及肿瘤微环境息息相关的趋化因子家族受到广泛关注[17-18,23]。临床上常通过轮换阿片类药物防治吗啡耐受，研究推测阿片受体调控可能是其中的关键机制，而相关机制的深入研究需要建立有针对性的动物模型[20]。

最常用的慢性癌性疼痛吗啡耐受前期模型是大/小鼠骨癌痛模型，建模成功后进一步建立吗啡耐受模型，连续6～10d给予实验鼠固定量吗啡。给药形式各异，可通过皮下注射，也可采用鞘内导管输注[20]。疼痛模型建立的验证可应用简易的热板和Von Frey试验，通过机械痛阈和热痛阈的变化充分反映吗啡耐受的存在，可表现为剂量–反应曲线右移，也可被进一步量化为最大镇痛效率[21]。建立该动物模型需要较多的实验动物分组，以验证诱导吗啡耐受和接受实验用药、安慰剂的不同结果[20]。在操作中，实验者需留意疼痛状态下动物对其他类型刺激的敏感性，以避免干扰行为学参数的读取[22]。目前的慢性癌性疼痛吗啡耐受模型模拟疼痛性状的能力较为成熟，模拟吗啡耐受状态的建模精度不足，部分实验倾向于使用三重对照组（生理盐水、吗啡、吗啡加实验药物），将重点置于比对实验药物对吗啡耐受的影响，而对吗啡耐受现象缺少足够标准的验证，存在对照组建立不完善、疼痛阈值测量间隔不统一等问题[24]。

4 模型动物的选择

疼痛对啮齿动物的行为具有显著影响，基础研究中常用的动物模型是雄性大鼠[25]。大鼠体型适中，行为训练期短，易操作、模拟损伤是其优势，小鼠饲养成本低、品系丰富。近年来，受转基因小鼠、化学遗传等因素影响，小鼠的应用也越来越多。狗等哺乳动物存在使用和饲养成本高等问题而极少使用。

研究发现，不足10%的小鼠研究使用远交系小鼠；而大鼠研究中，超过80%均使用远交系[26]。应用较多的C57BL/6近交系小鼠表现出对热刺激的高敏感性及对损伤引起的超敏反应的快速恢复性。在慢性疼痛的相关研究中，选择远交系小鼠或许能更好地模拟患者的慢性疼痛，具有“广泛性表型”的特征。慢性疼痛与复杂的生活史息息相关，应考虑这些因素对啮齿动物模型产生的影响，使用更具有异质性的动物模型。目前，大部分研究中的建模动物选择2～3月龄的大、小鼠，较适宜于急性疼痛的研究。综上，疼痛研究中选用远交系大/小鼠更具针对性，且应纳入月龄较大且不同性别的动物。

5 小结与展望

在急慢性疼痛的机制研究和药物筛选中，使用可靠的动物模型具有重要意义。然而，许多临床疼痛是目前的动物模型仅通过行为学变化无法模仿的，如幻肢痛、头痛、脊髓损伤导致的疼痛等。有学者提出，皮层可塑性可作为新的测量重点，补充行为学检测的不足[27]。随着基础研究的不断深入，各类疼痛动物模型将进一步优化，强调活体动物实验结合人体组织的体外研究，得以双向验证新的疼痛靶点可能是动物疼痛模型临床转化的重点。

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（2023–03–03）

（2023–09–08）

R739.9

A

10.3969/j.issn.1673-9701.2023.27.029

浙江省基础公益研究计划项目（LY19H290001）；浙江省康复医学会科研基金项目（ZKKY2023005）

龚黎燕，电子信箱：1413472557@qq.com