林思绮 司徒杰 （广州中医药大学第一附属医院 广州 510405）

金银花，是忍冬科植物忍冬Lonicera japonicaThunb.的干燥花蕾或带初开的花，性味甘、寒，2020年版《中国药典》明确其具有清热解毒、疏散风热之功效，现代研究表明其具有抗炎、抗病毒、抗菌、抗氧化、抗肿瘤、保肝、保护肺脏、降血糖、神经保护、增强免疫功能等多种生物活性［1］。连翘，是木犀科植物连翘Forsythia suspensa（Thunb.）Vahl 的干燥果实，性味苦、微寒，2020 年版《中国药典》明确其具有清热解毒、疏散风热、消肿散结之功效，现代研究表明其具有抗炎、抗菌、抗病毒、抗癌、抗氧化、保肝、抗阿尔茨海默病等多种生物活性［2］。二者在性味、功效、临床应用等方面高度一致，中医常将二者进行配伍相须使用，以增强清气凉血、清热解毒的功效，是温病治疗常用药对之一，如《温病条辨》所载的银翘散，能够显著发挥抗炎、解热、镇痛、抗过敏等作用［3］。此外，银翘解毒丸/片/胶囊/颗粒、双黄连口服液/片/栓/颗粒/滴眼液等多个中药制剂亦以金银花-连翘药对为主药［3］。

据相关研究［4-7］报道，金银花-连翘药对在抗病毒（流感病毒、呼吸道合胞病毒）、抗菌（溶珊瑚弧菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌）等方面能够起到协同作用；配伍后，抗炎作用更强，而且能够发挥单用连翘所不具备的解热作用。但是，目前对于不同配伍比例金银花-连翘药对的抗菌活性及作用机制研究报道甚少，无法为其临床治疗细菌感染性疾病提供理论依据。因此，本研究以金黄色葡萄球菌、大肠杆菌为革兰阳性菌、革兰阴性菌代表，采用K-B 纸片法、二倍微量稀释法测定不同配伍比例金银花-连翘药对的体外抗菌活性；通过生物化学法评价最佳配伍比例对受试菌株细胞壁、细胞膜的作用，从而为其配伍作用规律与临床应用提供科学的理论依据。

1 材料

1.1 菌株

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus arureus，S.aureus）ATCC 6538，购于广东省微生物研究所；大肠杆菌（Escherichia coli，E. coli）ATCC 25922，购于广东环凯微生物科技有限公司。

1.2 试药

金银花（批号：20221001，山东产地）、连翘（批号：20221215，河南产地），购于广州采芝林药业连锁有限公司；M-H 琼脂培养基（批号：20220516）、M-H 营养肉汤培养基（批号：20220910），购于青岛海博生物技术有限公司；碱性磷酸酶试剂盒（AKP，批号：20221103），购于江苏宝莱（酶免）生物科技有限公司。

1.3 仪器

SW-CJ-2FD 净化工作台，购于苏州净化设备有限公司；LX-B50L 型高压灭菌器，购于合肥华泰医疗设备有限公司；DHP-9082 恒温培养箱，购于上海一恒科技有限公司；Multiskan ™ FC 酶标仪，购于美国Thermo Fisher 公司。

2 方法

2.1 金银花-连翘药对提取制备

分别准确称取金银花、连翘药材各10.0 g 以及不同配伍比例（5∶1、4∶1、3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5）组合物各10.0 g，置于圆底烧瓶中，加入100 mL 水，加热回流煎煮1 h，提取2 次，合并过滤，真空浓缩至1.0 g/mL。

2.2 活化菌种与菌液制备

将低温保存的S. aureus、E. coli取出，室温解冻，接种于M-H 琼脂培养基，划线后置37 ℃培养20 h；挑选1～2 个单菌落，接种于M-H 营养肉汤培养基中，置37 ℃培养20 h，以标准麦氏比浊管比对稀释至浓度为1×106cfu/mL 的菌液。

2.3 抑菌圈直径（Inhibition zone diameter，IZD）测定

通过K-B 纸片法实验［8］，分别准确吸取“2.1”项下的金银花、连翘及不同配伍比例组合物提取液各10.0 μL 至直径为6.0 mm 的无菌药敏片，烘干；准确吸取“2.2”项下的S. aureus、E. coli菌液稀释液于M-H 营养琼脂板上，均匀涂布；将药敏片贴放于琼脂板上，置37 ℃培养20 h，取出测量IZD；平行3 份。判断标准：＞15 mm 为高度敏感，10～15 mm 为中度敏感，＜10 mm 为低度敏感。

2.4 最小抑菌浓度（Minimum inhibitory concentration，MIC）测定

通过96 孔板二倍微量稀释实验［8］，准确吸取“2.2”项下的S. aureus、E. coli菌液稀释液100.0 μL 于96 孔微量培养板每排的第1～12 孔，再分别准确吸取“2.1”项下的金银花、连翘及不同配伍比例组合物提取液各100.0 μL 至每排第1孔，吹打混匀，准确吸取100.0 μL 混合液至第2 孔，同理操作至第11 孔（弃去100.0 μL 混合液），第12 孔准确加入100.0 μL 的无菌水作为空白对照；置37 ℃培养20 h，肉眼观察，以孔中溶液未见浑浊者为MIC；平行3 份。

2.5 菌体细胞外AKP 含量的测定

通过生物化学法实验［8］，准确吸取“2.2”项下的S. aureus、E. coli菌液稀释液1.0 mL 于EP 管中，根据“2.4”项下的MIC 测定结果，分别加入适宜浓度的金银花、连翘及最佳配伍比例组合物提取液各1.0 mL，使得最终浓度均为MIC，另外以无菌水作为空白对照；置37 ℃培养6 h，取出后于10 000 r/min离心5 min，按照说明书操作测定上清液的AKP 活性；平行3 份。

2.6 菌体细胞外核酸含量的测定

通过生物化学法实验［8］，准确吸取“2.2”项下的S. aureus、E. coli菌液稀释液1.0 mL 于EP管中，根据“2.4”项下的MIC 测定结果，分别加入适宜浓度的金银花、连翘及最佳配伍比例组合物提取液各1.0 mL，使得最终浓度均为MIC，另外以无菌水作为空白对照；置37 ℃培养6 h，取出后于10 000 r/min 离心5 min，于酶标仪测定上清液的A260 值；平行3 份。

2.7 统计学方法

实验数据采用SPSS 19.0 软件进行t检验，以P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 不同配伍比例金银花-连翘药对的体外抗菌活性

由表1 实验测定结果可知，金银花、连翘单味药对S. aureus的IZD 为11.73、14.63 mm，MIC为62.5、15.63 mg/mL，对E. coli的IZD 为10.27、12.53 mm，MIC 为125.0、62.5 mg/mL；与金银花、连翘单味药相比，金银花-连翘药对在1∶1 比例时的IZD 最大、MIC 最低。

表1 不同配伍比例金银花-连翘药对对S. aureus、E. coli的IZD和MIC

分析不同比例（5∶1、4∶1、3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5）配伍发现，对S. aureus而言，当金银花占比逐渐降低（由5∶1 至1∶1），IZD 随着增加、MIC 随着降低，在1∶1 时表现出最佳抗菌作用；当连翘占比逐渐升高（由1∶1 至1∶5），IZD、MIC 均以1∶1 为最优，其他比例的IZD 有所减少，但MIC 均一致。对E. coli而言，当金银花占比逐渐降低，IZD 随着增加、MIC 随着降低，在1∶1 时为最佳抗菌作用；当连翘占比逐渐升高，IZD、MIC 均以1∶1 为最优，其他比例的IZD 随着减少，MIC 随着升高。

3.2 最佳配伍比例金银花-连翘药对的抗菌作用机制

图1、图2 结果显示，S. aureus、E. coli正常细胞外的AKP、核酸含量均比较低，但在金银花、连翘、金银花-连翘药对（1∶1）作用6 h 后，胞外AKP、核酸含量均显著增加（P＜0.05）；与金银花、连翘单味药相比，金银花-连翘药对（1∶1）在S. aureus 胞外核酸外泄量方面显著高于金银花（P＜0.05），在S. aureus、E. coli胞外AKP 含量、E.coli 胞外核酸含量方面虽然作用最强，但均无显著性差异（P＞0.05）。

图2 金银花-连翘药对对S. aureus、E. coli胞外核酸含量的影响

4 讨论

金银花-连翘药对在中成药制剂中的应用广泛，据不完全统计，目前已所涉及利咽解毒颗粒、小儿退热颗粒、金嗓开音丸等400 多个上市中成药品种，对感冒发烧、流行性腮腺炎、呼吸道感染、病毒性心肌炎等疾病均有疗效［4］。

通过以上研究发现，连翘对S. aureus、E. coli的抑菌作用均优于金银花，二者通过不同比例配伍，可表现出不同的体外抗菌活性，其中以金银花-连翘药对配伍比例为1∶1 时的作用最强，且优于单味药，起到协同增效的作用。同时，当金银花比例增加时，抗菌活性随着减弱，不同配伍比例测得的IZD、MIC 值均有较大差异；当连翘比例增加时，抗菌活性亦随着减弱，但不同配伍比例测得的IZD值略有差异，而MIC 值基本一致。这可能与金银花-连翘药对配伍前后以及不同配伍比例中的化学成分含量不同有关，如李莉等［9］亦测得芦丁、绿原酸、獐牙菜苦苷、獐牙菜苷、连翘脂苷A、木犀草苷、连翘苷和槲皮素等8 种成分在金银花-连翘配伍后的含量更高，可与金银花-连翘药对配伍后的抗菌活性强于金银花、连翘单味药相佐证。此外，丁影［10］测得金银花与连翘合煎液中各成分提取率明显大于单煎液和单煎合并液，同时金银花-连翘药对在3∶1、2∶1、3∶2、1∶1、2∶3、1∶2、1∶3等不同比例配伍下，以1∶1 比例中的绿原酸、咖啡酸、獐牙菜苦苷、獐牙菜苷、连翘酯苷A、芦丁、木犀草苷、连翘苷和槲皮素等9 个成分含量最高，可与金银花-连翘药对不同配伍比例的抗菌活性高低相佐证。

对于金银花-连翘药对的抗菌作用机制研究，发现配伍前后均能破坏S. aureus、E. coli的细胞壁、细胞膜的结构，使得通透性增大，致使菌体胞内的AKP 以及RNA、DNA 等核酸物质外泄，从而起到抑制细菌生长的作用；同时，与金银花、连翘单味药相比，金银花-连翘药对可以在更低的药物浓度下起到更强的破坏作用。

本研究测得金银花-连翘药对对S. aureus、E.coli均有良好的抗菌作用，且配伍后的体外抗菌活性优于单味药，同时不同配伍比例中，以1∶1 比例的体外抗菌活性最强，其作用机理可能与破坏细胞壁、细胞膜结构有关。