大麦醇溶蛋白启动子HorD的克隆及其种子特异性表达分析

2023-10-11刘宝龙姜燕燕常砚梓

麦类作物学报 2023年10期

刘宝龙,姜燕燕,2,曹东,常砚梓,李云

(1.中国科学院西北高原生物研究所/青海省作物分子育种重点实验室,青海西宁 810000; 2.青海大学农林科学院,青海西宁 810000)

启动子是决定基因时空特异性表达的重要因素之一,分为组成型、组织特异性和诱导型三种类型[1]。目前报道的一些组成型启动子,例如烟草花叶病毒35S(CaMV35S)和玉米Ubiquitin启动子,被广泛应用于植物基因工程领域[2-3],但不能满足特定基因在特定组织表达的需求。胚乳特异性启动子具有明显的组织和发育阶段特异性,可使外源基因在转基因植物种子胚乳中高效、特异表达,避免了非特异表达对植物造成的不利影响[4]。目前在水稻(OryzasativaL.)[5-6]、小麦(TriticumaestivumL.)[7-8]、玉米(ZeamaysL.)[9]和大麦(HordeumvulgareL.)[10]中已发现多种胚乳特异性表达启动子,但其中的大多数启动子由于表达特性不稳定等导致其应用受到限制[11-12]。在同一个植物中频繁使用同一种启动子驱动多个不同基因表达容易造成基因沉默现象[13-14]。为探明胚乳特异性基因的调控机理,需克隆更多的胚乳特异性表达启动子[15-16]。大麦醇溶蛋白是一种大麦胚乳特有的贮藏蛋白,占胚乳总蛋白的50%～60%[17],其基因启动子HorD具有胚乳特异性表达特性。

转基因植物作为生物反应器,具有完整的真核表达系统,可为多种外源蛋白提供正确的翻译后修饰,表达具有生物活性的外源蛋白,可应用于人或动物的疾病治疗及预防。相较于叶片、茎等表达系统,种子生物反应器具有产量高、生产成本低、储藏能力强、安全性高、远离动物携带的病菌等优点[18-19]。新型冠状病毒(SARA-CoV-2)刺突蛋白是开发重组疫苗的最佳候选蛋白,利用大麦种子生物反应器生产SARA-CoV-2抗原蛋白,实现抗原蛋白在种子中的大量积累,是抗击新型冠状病毒肺炎疫情的一种新策略。

本研究以大麦品种Golden promise为材料,克隆大麦醇溶蛋白启动子HorD,将该启动子和新型冠状病毒刺突蛋白基因LPS利用双酶切进行连接,构建植物表达载体phorD-LPS,通过农杆菌介导的遗传转化法获得大麦转基因株系,并分析HorD启动子的表达特性,以期为大麦胚乳特异型启动子HorD的应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试植物材料为春大麦Golden promise(Hordeumvulgaressp.distichum),属于二棱皮大麦,二倍体,含有53×108个碱基。培养条件为18 ℃光照16 h,15 ℃黑暗8 h。大肠杆菌DH5α和农杆菌EHA105分别购自上海生工生物工程股份有限公司和北京华越洋生物科技有限公司。质粒pU1300由本实验室保存。

1.2 启动子的克隆及序列分析

利用CTAB法[20]提取大麦叶片基因组DNA,根据Golden promise参考基因组(GPv1, INSDC Assembly GCA_902500625.1)中D-hordein基因(EF417989)的5’端序列,用Primer Premier 5.0 软件设计HorD启动子的特异性引物,在正向引物Hord-F中加上PstI酶切位点,在反向引物Hord-R中加上BamHI酶切位点(表1),采用常规PCR方法扩增大麦HorD的启动子序列,PCR反应体系为50 μL,包括2 × San Taq PCR Mix 25 μL,引物Hord-F/R (10 μmol · L-1)各1 μL,基因组DNA 1 μL,ddH2O 补足至50 μL。PCR反应程序:94 ℃预变性5 min;94 ℃变性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,32个循环;72 ℃再延伸10 min,4 ℃保温。利用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(天根,北京)对PCR产物进行回收。利用PlantCare在线网站(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)预测启动子含有的顺式作用元件。

1.3 phorD-LPS植物表达载体的构建

以pU1300载体为骨架,用HorD替换Ubi启动子,构建pU1300-phorD载体,具体步骤:将pU1300载体和HorD启动子片段分别用限制性内切酶PstI和BamHI进行双酶切,酶切总反应体系为50 μL,包括10×Fast Digest Green buffer 5 μL,DNA 20 μL,PstI和BamHI各2.5 μL,ddH2O补足至50 μL。混匀后在PCR仪中37 ℃酶切30 min。凝胶电泳后的pU1300骨架和HorD启动子片段分别进行胶回收,利用T4连接酶将二者连接,连接体系为10 μL,包括Liner vector DNA 1 μL,Insert DNA 3 μL,10×T4DNA Ligase Buffer 1 μL,T4DNA Ligase 0.5 μL,ddH2O补足至10 μL。通过热激法将连接产物转入大肠杆菌DH5α中,挑取阳性克隆并测序,获得pU1300-phorD载体。最后用限制性内切酶BamHI和SacI将新型冠状病毒刺突蛋白基因LPS(3 918 bp)片段(由金斯瑞生物科技股份有限公司合成)连接至载体pU1300-phorD,获得PhorD-LPS表达载体(方法同上),然后再进行双酶切鉴定,将正确的质粒送交测序。

1.4 农杆菌介导的大麦遗传转化

将大麦幼胚用70%的酒精表面消毒30 s,用灭菌水洗涤数次后,再用10%的次氯酸钠浸泡4 min,用灭菌水洗涤数次,然后用无菌滤纸擦干表面水分。将消毒过的大麦幼胚放入OD600=0.6的农杆菌菌液中,振荡培养20 min,倒掉菌液,将愈伤组织转移到无菌滤纸上,吸干表面残留的菌液,转入共培养培养基中,置于24 ℃培养箱中暗培养3 d,再转至含50 mg·L-1HYG(潮霉素)的抑菌筛选培养基进行培养,每隔14 d继代一次,将生长状态良好且致密的愈伤组织转移到含30 mg·L-1HYG的分化培养基上,24 ℃光照培养。待分化出绿芽后,转移至含30 mg·L-1HYG的再生筛选培养基上进行培养。每隔14 d继代一次,待绿苗长至2～3 cm,转移至含30 mg·L-1HYG的生根培养基中,待再生苗根系足够发达以及叶片健壮时,进行炼苗,一般为6～7 d,待炼苗完成后移栽至土壤中。移栽前需用自来水将残留的培养基冲洗干净。

1.5 转基因植株的PCR检测及LPS基因的表达模式分析

以植物表达载体phorD-LPS上的LPS为目标基因,用Primer Premier 5.0 软件设计引物LPS-F/R,以T0代抗性植株的叶片DNA为模板,以phorD-LPS载体为阳性对照,以野生型大麦叶片DNA为阴性对照,进行PCR检测。PCR反应体系为50 μL,包括2×San Taq PCR Mix 25 μL,引物LPS-F/R(10 μmol·L-1)各1 μL,基因组DNA 1μL,dd H2O 补足至50 μL。PCR反应程序:94 ℃ 5 min; 94 ℃ 30 s;55 ℃ 15 s;72 ℃ 1 min,35个循环;72 ℃ 10 min, 4 ℃保温。

用FastPure Plant Total RNA Isolation Kit(诺唯赞,南京)分别提取转基因大麦的根、茎、叶、内麸、外麸及种子总RNA。用PrimeSricptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Takara, 北京)将RNA反转录为cDNA。以LPS-F/R为引物(表1),以大麦ARF1为内参基因。使用ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix(诺唯赞,南京)进行qRT-PCR。PCR反应体系参照试剂盒说明书,PCR反应程序:95 ℃预变性30 s;95 ℃变性5 s,52 ℃退火34 s,72 ℃延伸20 s,40个循环。每个样品3个生物学重复。采用2-ΔΔCT法计算基因的相对表达量。

2 结果与分析

2.1 大麦启动子HorD的克隆及植物表达载体phorD-LPS的构建结果

以大麦基因组DNA为模板,利用特异性引物Hord-F/R进行PCR扩增,得到大麦HorD启动子片段(图1A),回收目的片段后进行测序,得知启动子HorD的全长为450 bp。用限制性内切酶BamHI和SacI将新型冠状病毒刺突蛋白基因LPS片段连接至载体pU1300-phorD,获得PhorD-LPS表达载体,经PCR验证和测序,发现所得片段(4 368 bp)与预期结果一致(图1B和1C),表明构建的载体phorD-LPS正确,可用于后续分析。

A:大麦HorD启动子的克隆结果;B:phorD-LPS载体的构建结果;C: phorD-LPS载体示意图。A图和B图中,M:DL5000;1和2为两个重复。A: Cloning result of HorD promoter in barley; B: Construction results of phorD-LPS vector; C: Schematic diagram of phorD-LPS vector. In figures A and B, M: DL5000; 1 and 2 were two repelicates.图1 大麦HorD启动子的克隆及phorD-LPS表达载体的构建结果Fig.1 Cloning result of HorD promoter in barley and construction result of phorD-LPS expression vector

2.2 HorD启动子区域含有的顺式作用元件

PlantCare在线网站分析结果(表2)表明,HorD启动子除含有必需的基本顺式作用元件(A-box、TATA-box和CAAT-box)外,还包含一个胚乳特异性表达元件Prolamin-box。

表2 HorD启动子含有的顺式作用元件Table 2 Cis-acting elements of HorD promoter

2.3 农杆菌介导的大麦遗传转化及转基因植株检测

通过农杆菌介导的遗传转化法将LPS启动子转入大麦基因组中(图2A)。以大麦转基因植株叶片基因组DNA为模板,以LPS-F/R为引物对转基因植物进行PCR检测,结果(图2B)表明,在所检测样品中,有6株能够扩增出与目的片段大小相同的条带,表明这6株再生苗为阳性植株。

A:大麦的遗传转化; a:共培养;b:筛选培养;c:继代培养;d:分化培养;e:生根培养;f:移栽。B:转基因植株的PCR检测结果;M:DL5000;1～6:阳性植株;H2O:阴性对照;P:阳性对照。A: Genetic transformation of barley, a: Co-culture; b: Screening culture; c: Subculture; d: Differentiation culture; e: Rooting culture; f: Transplanting. B: PCR result of transgenic plants, M: DL5000; 1-6: Negative control; P: Positive control.图2 农杆菌介导的大麦遗传转化及转基因植株的PCR检测结果Fig.2 Agrobacterium-mediated genetic transformation of barley and PCR results of the transgenic plants

2.4 LPS基因在转基因大麦不同组织中的表达量

从图3可以看出,LPS基因在大麦不同组织中均有表达,但表达量存在差异。以根中LPS基因的表达量为参照(相对表达量为1),种子中LPS基因的表达量最高,为9.29,与根中LPS基因的表达量在0.0001水平上达到显著水平;叶片和内麸中LPS基因的表达量次之,与根中LPS基因的表达量分别在0.001和0.01水平上达到显著水平;而叶和外麸中LPS基因的表达量与根中LPS基因的表达量无显著差异。

**、***和****分别表示与根中LPS的表达量在0.01、0.001和0.0001水平差异显著。**、*** and **** indicate significant difference compared with the expression level of LPS gene in root at 0.01、0.001 and 0.0001 levels, respectively.图3 大麦不同组织中LPS基因的相对表达量Fig.3 Relative expression level of LPS gene in different tissues of barley

3 讨论

外源基因在植物体内的表达受拷贝数、插入位置、启动子类型等诸多因素的影响,但很大程度上依赖于驱动外源基因表达的启动子[21]。关于启动子的研究有很多,比如liu等[22]利用水稻GluB-1启动子驱动大豆铁蛋白基因在水稻种子中表达;Murase等[23]利用水稻oleosin启动子驱动外源亚油酸异构酶基因在水稻种子中特异表达;Kuwano等[24]利用水稻Ole18启动子驱动RIN01基因在种子中特异表达。本研究则是利用大麦HorD启动子驱动新型冠状病毒刺突蛋白基因LPS在大麦中表达,分析HorD启动子的表达特性。

利用分子生物学技术,HorD启动子已在大麦中实现了瞬时表达[25-27],在烟草中也获得了稳定转化[28]。本研究通过农杆菌介导的遗传转化,分析大麦HorD启动子的功能。相较于瞬时转化,采用农杆菌介导的稳定转化法来分析HorD启动子的功能,更能准确反映HorD启动子的表达模式[26,29]。研究表明,HorD启动子不仅可以在大麦籽粒胚乳中特异表达[30-31],还可调控GFP在根中表达[32]。在大麦胚乳细胞中瞬时表达分析结果显示,HorD启动子的活性是HorB启动子的3～5倍[27]。也有研究表明,HorD启动子驱动的GUS仅在稳定转化植株的胚乳组织中表达,而在其他组织中不表达[27,33]。

本研究克隆的HorD启动子序列全长为450 bp,而Sørensen等[27]克隆的HorD启动子序列全长仅433 bp,且包含胚乳特异表达所需的所有顺式作用元件,除含有核心顺式作用元件CAAT-box和TATA-box外,还含有胚乳特异性表达的特有元件Prolamin-box。为验证HorD启动子的功能,本研究构建了植物表达载体phorD-LPS,并转化至大麦幼胚,通过潮霉素抗性筛选及LPS基因的PCR鉴定,获得阳性植株。qRT-PCR分析表明,HorD启动子驱动LPS基因在转基因大麦的根、茎、叶、颖壳和种子中均有表达,其中在种子中表达量最高,而在其他组织中表达量相对较低。这表明,HorD启动子可驱动外源基因在种子中高效表达,为种子特异性启动子。