宋 晓,黄绍敏,张珂珂,王沙沙,李向东,杨 程,杨天军

(1.河南省农业科学院植物营养与资源环境研究所,河南郑州 450002;2.河南省农业科学院小麦研究所/河南省小麦生物学重点实验室,河南郑州 450002;3.安阳市土壤肥料工作站,河南安阳 455000)

酵母双杂交系统(yeast two hybrid system,Y2H)是研究植物体内蛋白质与蛋白质之间相互作用的一种常用的分子生物学技术[1]。随着分子技术以及现代分子生物学技术的快速发展,该技术已广泛应用于植物[2-3]、动物[4]、微生物[4-5]等物种当中。例如,Chini等[2]利用Y2H检测技术识别了以高通量的方式直接调节植物激素感知复合物的小分子。Liu等[3]利用抑制活性试验和改良的酵母双杂交研究木聚糖酶抑制剂(RIXI)对水稻致病机制时发现, RIXI对11个家族木聚糖酶的抑制活性随RIXI-木聚糖酶复合物的相互作用强度而提高,表明两者呈正相关。Lai 等[5]利用酵母双杂交技术成功研究了弓形虫的侵入机制。另外,该技术在人类疾病[6-7]和药物研究[8]应用方面也取得了较大的进步,尤其是在研究人类帕金森病的发病机制方面[8]。

普通小麦(Triticumaestivum, 2n=6X=42,AABBDD)为异源六倍体,遗传背景极其复杂,拥有巨大的基因组(≈17.9 Gb)[9]和冗余的重复序列(>80%),与水稻(≈400 Mb)、玉米(≈3 Gb)等[10]基因组相对较小的作物相比,其功能研究和作用机制研究较其它作物困难。尽管如此,酵母双杂交技术在小麦功能基因组学研究方面也得到了较好的应用。2020年,Yu等[11]利用酵母双杂证实了小麦蛋白磷酸酶PP2C-a10可与小麦延迟萌发蛋白TaDOG1L1(DELAY OF GERMINATION 1)和TaDOG1L4相互作用,促进转基因拟南芥种子萌发,降低种子的耐旱性。2021年,Kim等[12]利用酵母双杂技术成功验证了编码RNA聚合酶ii相关因子1(PAF1)基因TaELF7可与环型E3连接酶TaHUB2直接相互作用,为解析该基因在小麦小花发育和扬花阶段起负调控因子的作用机制奠定了基础。除此之外,该技术在研究小麦产量[13-15]、品质[16]、干旱胁迫[17]等方面也发挥了重要作用。

氮作为一种必要的大量元素对植物生长发育有非常重要的作用,在小麦中,合理使用氮肥,提高氮肥利用效率,对增加小麦产量,改善小麦品质至关重要[18]。近年来,许多学者在小麦硝酸盐转运蛋白1(nitrate transporter 1,NRT1)家族[19-20]以及单个家族成员[21]对提高小麦氮肥利用效率方面做了大量的研究。2022年,小麦硝酸盐转运蛋白基因TaNRT1.1-1A(TraesCS1A02G210900.1)、TaNRT1.1-1B(TraesCS1B02G224900.1)和TaNRT1.1-1 D(TraesCS1D02G214200.1)被克隆了出来;其中,TaNRT1.1-1A基因和TaNRT1.1-1B基因可能在硝酸盐的吸收过程中发挥了重要作用,TaNRT1.1-1D基因可能在硝酸盐转运方面发挥了重要作用[21]。但这些基因是如何在小麦体内发挥作用的,和它相互作用的蛋白有哪些,并不知晓。因此,本研究通过对小麦TaNRT1.1-1A自激活检测,并利用酵母双杂交技术筛选与TaNRT1.1-1A互作的候选蛋白,为进一步阐明 TaNRT1.1-1A调控小麦硝酸盐吸收有关的分子机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

酵母双杂交载体pGBKT7、酵母菌株Y2H Gold、小麦百农矮抗58的cDNA文库均由河南农业大学农学院/省部共建小麦玉米作物学国家重点实验室提供;酵母双杂交载体pGADT7-T、阴性对照pGBKT7-Lam[22]、阳性对照pGBKT7-P53[22]以及小麦TaNRT1.1-1A-pMD18-T质粒DNA(包括TaNRT1.1-1ACDS序列全长)由河南省农业科学院小麦资源与环境研究所土壤研究室保存。

1.2 TaNRT1.1-1A诱饵载体的构建及酵母转化

根据小麦TaNRT1.1-1A基因编码区序列(TraesCS1A02G210900.1)及pGBKT7载体序列,设计特异性引物(TaNRT1.1-1A-F: GAATTCATGGGCTCGGTGCTGC; TaNRT1.1-1A-R: GGATCCTCAGTGACCGACGATCA),在该基因两端分别引入EcoR I和BamH I(Promega, 美国)酶切位点。以小麦TaNRT1.1-1A-pMD18-T质粒DNA为模板进行 PCR 扩增,PCR扩增体系和扩增程序参照王沙沙等[21]的方法进行操作。1%琼脂糖凝胶电泳用于检测目的片段。目的片段回收和纯化后,同时与pGBKT7载体进行双酶切、连接、转化大肠杆菌DH5α。

利用特异性引物TaNRT1.1-1A-F/R进行单克隆菌落的PCR检测, 筛选阳性克隆,并测序验证融合质粒pGBKT7-TaNRT1.1-1A克隆正确。利用 PEG/LiAC 介导酵母转化方法,将pGBKT7-TaNRT1.1-1A+pGADT7载体、阳性对照pGBKT7-T+pGADT7-p53、 阴性对照pGBKT7-T+pGADT7-Lam转化至Y2H Gold感受态细胞中。

1.3 诱饵表达载体pGBKT7-TaNRT1.1-1A的自激活检测

将含pGBKT7-TaNRT1.1-1A的酵母菌、阴性对照和阳性对照分别涂布SD-Trp/-Leu、SD-Trp/-Leu/-His/X-α-Gal、SD-Trp/-Leu/-His/-Ade/X-α-Gal平板筛选培养,验证pGBKT7-TaNRT1.1-1A是否具有自激活活性。

1.4 诱饵质粒、小麦百农矮抗58文库质粒的扩繁和制备

分别挑取诱饵质粒(pGBKT7-TaNRT1.1-1A)和百农矮抗58的新鲜菌斑到500 μL LB液体培养基中进行重悬后,加入到 200 mL LB液体培养基(50 μg·mL-1Amp)中,37 ℃过夜培养。分别提诱饵质粒、文库质粒DNA备用。

1.5 TaNRT1.1-1A互作蛋白的筛选

按照MatchmakerTMGold Yeast Two-Hybrid System User Manual(Clontech,Cat.No.630489)的方法将已构建pGBKT7-TaNRT1.1-1A诱饵质粒10 μg及小麦酵母双杂交文库质粒40 μg混合均匀,转入10 mL的Y2H Gold酵母感受态细胞中,振荡混匀。加入6 mL 1×PEG/liAc混合液,再次振荡混匀。30 ℃ 200 ～230 r·min-1,振荡培养30 min。加入200 μL的DMSO,上下温和颠倒混匀。42 ℃热激15 min后迅速置于冰上2～3 min。瞬时离心,12 000 r·min-1,5～10 s。弃上清,加入8 mL 0.25×YPDA重悬混匀。取200 μL菌液均匀涂布于SD-Trp/-Leu/-His/X-Gal/AbA培养基上,30 ℃倒置培养3～5 d。待菌斑长到直径2 mm大小时,将蓝色克隆转移至SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade/X-α-Gal/AbA培养基上继续筛选,设置阴性对照和阳性对照,3次重复,二次筛选阳性克隆即为候选克隆。提取筛选获得的阳性克隆质粒,用特异性引物对(AD-F:CGGCTAGTAAAATTGATGATGGTAATAATTCA;AD-R:CACAGTTGAAGTGAACTTGCGG)对阳性克隆进行菌液PCR鉴定,并送样测序。利用NCBI 的BLAST database(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)对所测得的序列进行同源性分析,初步确定互作蛋白的基因及蛋白信息。

1.6 TaNRT1.1-1A互作蛋白的回转验证

为验证pGBKT7-TaNRT1.1-1A与候选蛋白存在互作,将构建好的pGBKT7-TaNRT1.1-1A质粒与pGADT7-候选互作蛋白质粒,通过酵母双杂交的方法共转于Y2H Gold酵母感受态细胞中,依次涂布于SD-Trp/-Leu/-His+/X-α-Gal/AbA和SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade/X-α-Gal/AbA培养基上,培养3～5 d。设置阳性和阴性对照,3次重复, 观察共转酵母质粒在平板上的生长情况。

2 结果与分析

2.1 诱饵表达载体pGBKT7-TaNRT1.1-1A的构建

将小麦TaNRT1.1-1A CDS序列连接到载体pGBKT7上,重组载体质粒转入DH5α感受态细胞中,并对所得单克隆进行菌液PCR检测,结果如图1所示,目的片段与基因片段(1 803 bp)大小一致。提取大肠杆菌质粒并测序,测序结果比对正确,说明 pGBKT7-TaNRT1.1-1A诱饵载体构建成功。

M:DL2000; 1～3为pGBKT7-TaNRT1.1-1A菌液PCR片段。M: DL2000; 1-3 represent the PCR fragments of positive colony of pGBKT7-TaNRT1.1-1A图1 阳性克隆菌液PCR电泳检测Fig.1 PCR electrophoresis detection of positive colony

2.2 诱饵表达载体pGBKT7-TaNRT1.1-1A的自激活检测

为验证TaNRT1.1-1A是否具有自激活活性,将pGBKT7-TaNRT1.1-1A重组载体、阴性对照pGBKT7-Lam和阳性对照pGBKT7-p53分别与pGADT7共同转入酵母菌株Y2H Gold感受态细胞中。3 种质粒转入酵母后在单缺培养基(SD/-Trp)上均能够生长,说明这 3 种质粒转入到酵母中。阴性对照在X-α-Gal 的三缺、四缺培养基上不能生长,含有 pGBKT7-TaNRT1.1-1A重组载体的酵母和阳性对照在含有X-α-Gal 的三缺、四缺培养基上均能正常生长,而且均能显示蓝色,说明TaNRT1.1-1A能够激活下游报告基因的表达,TaNRT1.1-1A编码的蛋白具有自激活功能(图2)。

图2 pGBKT7-TaNRT1.1-1A 诱饵载体转化酵母自激活检测Fig.2 Detection of self-activation of pGBKT7-TaNRT1.1-1A bait vector

2.3 TaNRT1.1-1A互作蛋白的筛选

将小麦百农矮抗58文库质粒DNA和无自激活活性的诱饵表达载体pGBKT7-TaNRT1.1-1A通过质粒共转的方法转化Y2H Gold酵母感受态中,依次涂布于SD/-Trp/-Leu/-His、SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade 以及SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade/X-α-gal/AbA营养缺陷型培养基上,30 ℃培养 3～5 d,经3次连续筛选,共获得38个蓝色单克隆菌落(图3)。

1～38是筛选获得的互作蛋白阳性克隆; -表示阴性对照; +表示阳性对照。1-38 are positive colonies of TaNRT1.1-1A interacting proteins; - represents the negative control; + represents the positive control.图3 小麦硝酸盐转运蛋白 TaNRT1.1-1A互作蛋白的筛选Fig.3 Screening of candidate interacting protein for nitrate transporter TaNRT1.1-1A in wheat

2.4 候选互作蛋白的鉴定及其序列分析

利用特异性引物对所获得的阳性克隆进行PCR检测。结果发现,筛选获得的阳性克隆均能获得扩增条带(图4)。将筛选获得阳性克隆进行酵母质粒提取,转化大肠杆菌DH5α,并进行序列测定。将所获得的序列进行BLAST比对分析,确定2种与TaNRT1.1-1A候选互作蛋白,它们分别为XP_044340979.1和XP_044344556.1 (表1)。其中XP_044340979.1是与植物致病有关的含丝氨酸天冬氨酸重复序列蛋白Sdr I-like,XP_044344556.1是未知蛋白。

M:DL6000;1～38为互作蛋白阳性克隆PCR条带;-表示阴性对照;+ 表示阳性对照。M:DL6000;1-38:PCR bands of interaction positive clones;- represents the negative control;+ represents the positive control.图4 互作阳性克隆PCR检测Fig.4 PCR detection of interacting positive colonies

表1 TaNRT1.1-1A蛋白酵母双杂交筛选得到的阳性克隆信息Table 1 Screening of the TaNRT1.1-1A protein positive colony information by yeast two-hybrid system

2.5 TaNRT1.1-1A与互作蛋白Sdr I-like的回转验证

将筛选获得的含候选蛋白Sdr I-like的质粒(阳性克隆A1-21)和诱饵载体进行一对一验证, 经酵母转化后在 SD/Ade/His/Leu/Trp/X-α-Gal/AbA 四缺平板上生长, 显示该克隆能长出蓝色克隆(图5), 说明筛选获得的阳性克隆可能与TaNRT1.1-1A存在互作关系。

图5 小麦TaNRT1.1-1A蛋白与候选互作蛋白Sdr I-like回转验证Fig.5 Validation of TaNRT1.1-1A and candidate protein Sdr I-like of wheat

3 讨论

合理使用氮肥,提高小麦的氮素利用效率对增加小麦产量、保证国家粮食安全以及促进农业的可持续发展等均具有重要意义。硝酸盐转运蛋白(NRT1.1)作为植物吸收和转运的主要载体在提高小麦氮肥利用效率方面发挥了重要作用。因此,开展与小麦硝酸盐转运蛋白相关研究对提高小麦氮肥利用效率,增加小麦产量至关重要。许多学者首先针对小麦庞大的、复杂的NRT1家族成员进行了鉴定。例如,小麦NPF(NRT1)转运基因家族成员的复杂组成[23]、染色体位置、进化关系和表达谱等[19]方面。随着分子生物学技术的快速发展以及各种小麦数据库平台的建立和健全,小麦TaNRT1转运蛋白基因家族的鉴定工作取得了更大的进步。 郭志强等[20]通过借助生物信息学的数据库对小麦TaNRT1转运蛋白基因家族77个成员进行了系统的鉴定,可为后续相应基因的功能组学研究奠定基础。除此之外,在其单个基因功能的研究方面也取得了较大的进展。王沙沙等[21]从小麦中克隆了水稻硝酸盐转运蛋基因OsNRT1.1B在小麦中的三个同源基因TaNRT1.1-1A、TaNRT1.1-1B和TaNRT1.1-1D。不同组织qRT-PCR分析结果表明,TaNRT1.1-1A基因和TaNRT1.1-1B基因对硝酸盐的吸收过程发挥重要作用,而TaNRT1.1-1D基因对硝酸盐在植物体内的转运方面发挥重要作用。另外,在研究TaNRT1.1-1A基因等位变异与氮利用效率之间关系时发现,其启动子上游-1 120 bp 位置8 bp(TGCATGCA)插入位点与TaNRT1.1基因的高表达与氮利用效率密切相关。不同基因型小麦品种的qRT-PCR分析结果表明,TaNRT1.1基因表达可能正调控小麦氮利用效率。该研究初步明确了TaNRT1.1基因的生物学功能,并为后期对其进行功能标记开发以及功能研究奠定基础。

本研究分析了TaNRT1.1-1A的转录激活活性,结果表明:TaNRT1.1-1A不具有转录激活活性。随后以TaNRT1.1-1A为诱饵蛋白,利用酵母双杂技术筛选小麦百农矮抗58的酵母cDNA文库,获得了2个无重复性候选互作蛋白。由于普通小麦具有庞大的基因组[9]和冗余的重复序列,遗传基础极其复杂,对其进行功能基因组学研究较为困难。本研究通过酵母双杂交技术成功找到TaNRT1.1-1A的互作蛋白,该方法可为解析与小麦氮吸收相关的分子机制及其调控机理奠定了基础。

Sdr I是从腐生葡萄球菌菌株7108中鉴定出来的一种丝氨酸-天冬氨酸重复蛋白,研究表明,该蛋白是生物致病(包括人体尿路感染)的重要因素[24]。另有研究证实,NRT1转运蛋白基因正调控植物致病。如Pike等[25]研究葡萄和拟南芥白粉病等致病机制影响时发现,在其感病的植株叶片内,该蛋白基因上调表达。本研究通过酵母双杂交技术筛选到了小麦TaNRT1.1-1A的互作蛋白Sdr I-like,推测TaNRT1.1-1A可能与其相互作用,参与小麦病害有关的调控机制。早期的研究证实,过度施用N肥可导致小麦锈病、白粉病、叶枯病以及穗部交链孢菌黑霉病等各种病害的发生[26-27]。因此,进一步推测TaNRT1.1-1A可能与Sdr I-like蛋白相互作用,通过调控N肥的吸收、转运,进一步提高氮肥利用效率,减少小麦病害的发生,最终提高小麦产量。但二者是如何发挥作用有待进一步深入研究。

4 结论

小麦硝酸盐转运蛋白TaNRT1.1-1A无自激活活性;以 TaNRT1.1-1A为诱饵,筛选获得了与植物抗病等相关的2个TaNRT1.1-1A候选互作蛋白;利用酵母双杂交技术对其候选互作蛋白Sdr I-like进行了回转验证。该研究结果为深入解析TaNRT1.1-1A调控小麦氮吸收相关的分子机制奠定了基础。