左宏旭,雷 琼,刘叩晗,王欣桐,王保通

(1.西北农林科技大学植物保护学院/旱区作物逆境生物学国家重点实验室,陕西杨凌 712100;2.杨凌职业技术学院生物工程分院,陕西杨凌 712100)

镰刀菌属(Fusariumspp.)真菌可使小麦穗部、茎秆和茎基部分别产生赤霉病、秆腐病和茎基腐病,同时其产生的镰刀菌毒素不仅严重影响小麦产量和品质,也危害人畜健康,是制约中国小麦产业健康发展的重要因素[1-2]。

小麦赤霉病由镰刀菌复合群引起,其中禾谷镰刀菌(Fusariumgraminearum)为优势病原菌[3-4]。20世纪80年代,全国小麦赤霉病研究协作组对国内21个省(直辖市、自治区)的小麦赤霉病病原菌进行了调查,认为国内小麦赤霉病病原菌至少存在18种,其中禾谷镰刀菌占比高达约94.5%[5]。受地域气候以及作物轮作的影响,不同麦区的小麦赤霉病优势病原菌不同,西北麦区、华北麦区、黄淮麦区及其以北的麦区以禾谷镰刀菌为优势病原菌,而长江中下游麦区的优势病原菌为亚洲镰刀菌(F.asiaticum)[6]。与小麦赤霉病相比,小麦秆腐病研究较少,但两种病害由相同的病原菌引起[7];小麦茎基腐病与赤霉病和秆腐病也有部分相似的病原菌,也因地域气候的不同存在不同的病原菌种群,但假禾谷镰刀菌(F.pseudograminearum)是小麦茎基腐病的优势病原菌[8-12]。因此,镰刀菌属病原菌可侵染小麦的不同部位,部分病原菌能够同时侵染小麦的穗部、茎秆和茎基部,这使得小麦赤霉病、秆腐病和茎基腐病可能互相成为侵染源,加重整株小麦的患病率和病害严重度。

B型单端孢霉烯族毒素是镰刀菌产生的主要毒素,主要可分为脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol, DON)和雪腐镰刀菌烯醇(nivalenol, NIV)两类毒素,其中DON毒素存在两种乙酰化衍生物,分别为3-乙酰DON(3-ADON)和15-乙酰DON(15-ADON)[13]。禾谷镰刀菌产生的毒素大多为15-ADON[14-15],少数为3-ADON和NIV[16]。

2010年以来,全国大力推行秸秆还田政策,导致小麦病残体上的病原菌大量繁殖,极大增加了镰刀菌越冬菌群的数量,成为来年的初侵染源[17]。因此,探究小麦不同部位镰刀菌的病原菌种类及其毒素化学型对于大田精确防治镰刀菌病害及种群动态监测具有重要意义。本研究对陕西省部分地区小麦进行取样分析,明确其穗部、茎秆和茎基部的镰刀菌病原菌种类及其毒素化学型,以期为制定大田综合防治策略提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 样品的采集

于2022年小麦灌浆期,从陕西省渭南市、宝鸡市、咸阳市和西安市采集小麦发病样本,选择在穗部、茎秆和茎基部至少有一处发病的小麦,采用棋盘式取样法在每个采样田块中随机选取10～15株具有明显发病症状的小麦,用信封袋封装、编号并留存。

1.2 病原菌的分离与纯化

采用组织分离法对采集到的样本进行病原菌分离,将发病症状明显的部位于病健交界处裁剪成边长约5 cm的小方块,先置于2%的次氯酸钠溶液中浸泡消毒1 min,再用75%的酒精消毒20 s,无菌水冲洗3次[18],然后用灭菌滤纸吸干水分后将样品接种于PDA培养基中,置于25 ℃培养箱中培养3 d。

依据菌落颜色和形态对分离到的真菌进行初步判断,在PDA培养基上培养1 d后产生棉白色丝状菌丝,3 d后菌落产生浅洋红色色素,5～7 d后菌丝长满整个培养基,色素变为紫红色的菌株初步断定为镰刀菌[19]。将这些候选镰刀菌的菌饼接种至CMC液体培养基中,25 ℃、180 r·min-1摇床培养3 d后,用滤纸滤去菌丝得到孢子悬浮液,在显微镜下可观察到这些孢子有隔膜且呈镰刀状,将孢子悬液浓度稀释至1×103个·mL-1;制备3%的水琼脂并用无菌刀片分割成边长为3 mm的小方块,吸取1 μL稀释后的孢子悬液点于其上[19]。在显微镜下选取仅有一个分生孢子的琼脂块,将其接种于PDA培养基上,25 ℃培养3 d,即为纯化的镰刀菌病原菌。

1.3 病原菌分子鉴定

采用真菌基因组DNA小量快速提取的方法[20]提取分离纯化的病原菌基因组DNA,并以此为模板,采用真菌核糖体DNA(rDNA)的ITS区段通用引物ITS1(5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGC-3’)和ITS4(5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)进行PCR扩增[21]。PCR反应体系为50 μL,包括2×M5 HiPer plus Taq HiFi PCR mix 25 μL,ITS1和ITS4引物各2 μL,DNA模板1 μL,ddH2O补足至50 μL。PCR反应程序:95 ℃预变性5 min;94 ℃变性25 s,58 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,共35个循环;72 ℃再延伸5 min,4 ℃保存。PCR扩增产物交由生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序,将测序结果在NCBI数据库中进行比对。

1.4 镰刀菌毒素化学型的鉴定

采用引物Tri13P1(5’-CTCSACCGCATCGAAGASTCTC-3’)和Tri13P2(5’-GAASGTCGCARGACCTTGTTTC-3’)对镰刀菌产毒化学型进行分析[22]。PCR反应体系为25 μL,包括2×M5 HiPer plus Taq HiFi PCR mix 12.5 μL,Tri13P1和Tri13P2引物各1 μL,DNA模板0.5 μL,ddH2O补足至25 μL。PCR反应程序:94 ℃预变性4 min;94 ℃变性1 min,58 ℃退火40 s,72 ℃延伸40 s,共35个循环;72 ℃再延伸6 min,4 ℃保存[22]。用1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物。3-ADON型、15-ADON型和NIV型菌株的预期扩增片段长度分别为644、583和859 bp[22]。

2 结果与分析

2.1 小麦不同部位镰刀菌种群的分布

结合菌落形态学和分子生物学鉴定,通过单孢分离技术共分离到156株镰刀菌菌株(表1),部分镰刀菌的PCR结果见图1。从穗部分离到62株菌株,其中禾谷镰刀菌56株,黄色镰刀菌(F.culmorum)4株,亚洲镰刀菌2株,分别占比90.32%、6.45%和3.23%;从茎秆分离到43株菌株,其中禾谷镰刀菌39株,黄色镰刀菌4株,分别占比90.70%和9.30%;从茎基部分离到51株菌株,其中假禾谷镰刀菌43株,三线镰刀菌(F.tricinctum)4株,禾谷镰刀菌3株,层出镰刀菌(F.proliferatum)1株,分别占比84.32%、7.84%、5.88%和1.96%(表2)。

M:DL2000;1～11:镰刀菌菌株;N:阴性对照。M:DL2000; 1-11: Fusarium strains; N: Negative control.图1 部分镰刀菌菌株ITS区段的PCR结果Fig.1 PCR results of ITS fragments in partial Fusarium strains

表1 供试菌株来源Table 1 Sources of the tested strains

表2 分离到的菌株分布及种群组成Table 2 Distribution and population composition of the isolated strains

上述结果说明,陕西省小麦镰刀菌至少存在禾谷镰刀菌、亚洲镰刀菌、黄色镰刀菌、假禾谷镰刀菌、三线镰刀菌和层出镰刀菌6种菌株。发生在穗部的小麦赤霉病与发生在茎秆部的小麦秆腐病的优势病原菌一样,均为禾谷镰刀菌;而发生在茎基部的小麦茎基腐病则以假禾谷镰刀菌为优势病原菌。禾谷镰刀菌可同时侵染小麦的穗部、茎秆和茎基部,占分离菌株总数的62.82%,因此,禾谷镰刀菌是造成陕西省小麦镰刀菌病害的优势病原菌。

2.2 小麦不同部位镰刀菌的毒素化学型

通过PCR检测镰刀菌毒素的化学型,部分菌株的PCR结果见图2。在分离得到的156株镰刀菌菌株中,产生15-ADON毒素的菌株102株,为15-ADON化学型,占比65.38%;产生3-ADON毒素的菌株54株,为3-ADON化学型,占比35.26%;未检测到能够产生NIV毒素的菌株(表3)。其中从茎秆分离到的一株黄色镰刀菌菌株检测到15-ADON和3-ADON两种毒素化学型。

M:DL2000;1～23:镰刀菌菌株;N:阴性对照。M: DL2000; 1-23: Fusarium strains; N: Negative control.图2 部分镰刀菌毒素的PCR结果Fig.2 PCR results of toxin in partial Fusarium strains

表3 分离到的镰刀菌产毒化学型Table 3 Toxic chemotype of the isolated Fusarium strains

从穗部分离到的62株菌株中,15-ADON和3-ADON化学型分别占比70.97%和29.03%,56株禾谷镰刀菌中,15-ADON和3-ADON化学型分别占比73.21%和26.79%;从茎秆分离到的43株菌株中,15-ADON和3-ADON化学型分别占比74.42%和27.91%,39株禾谷镰刀菌中,15-ADON和3-ADON化学型分别占比74.36%和25.64%。通过对比发现,这两处部位禾谷镰刀菌的毒素化学型占比接近,推测禾谷镰刀菌侵染小麦穗部或茎秆对其毒素的化学型不具有选择性。从小麦茎基部分离到的51株菌株中,15-ADON和3-ADON化学型分别占比50.98%和49.02%,与小麦穗部和茎秆的镰刀菌毒素化学型占比存在明显差异,43株假禾谷镰刀菌中,15-ADON和3-ADON化学型分别占比48.84%和51.16%。在整株小麦上分离到的98株禾谷镰刀菌中,15-ADON化学型占比74.49%;而43株假禾谷镰刀菌中,15-ADON化学型仅占比48.84%。

3 讨论

小麦赤霉病作为小麦穗部的重要病害,其病原镰刀菌种群结构在陕西省已有多年未被研究报道。与全国小麦赤霉病研究协作组在1975-1980年的研究结果[7]相比,本研究在穗部分离到的优势病原菌(禾谷镰刀菌)占比降低了4.02%,且分离获得了之前未有的黄色镰刀菌和亚洲镰刀菌,可见气候和耕作方式的改变在一定程度上影响了陕西省小麦穗部镰刀菌的种群结构。与发生在穗部的小麦赤霉病相比,发生在茎秆的小麦秆腐病以及发生在茎基部的小麦茎基腐病的研究报道就显得尤为稀少,在陕西省则更是鲜有报道。小麦秆腐病已经在澳洲、北美等地区流行,引起了较为广泛的关注[23],因此我们也应重视该病害的发生与传播。本研究结果表明,小麦秆腐病和赤霉病具有较为相似的镰刀菌种群结构,尽管二者不同菌株占比存在差异,但在防治小麦赤霉病的同时,小麦秆腐病也可以被联防,但还需要进一步验证。小麦茎基腐病则与赤霉病和秆腐病的镰刀菌种群结构差异较大,其优势病原菌为假禾谷镰刀菌,这与朱运启等[24]的研究结果一致,但其占比下降了5.41%,原因可能与小麦扬花期和灌浆期的气候差异有关。综合分析小麦这三个部位分离到的镰刀菌,发现小麦茎基部对镰刀菌种群结构具有一定的选择作用,这种选择性可能与茎基部离土壤较近,受土壤中多种因素的影响有关。因此,小麦茎基腐病与赤霉病和秆腐病的防治方法不同,才能达到更为精确、高效的防治效果。

在镰刀菌产生的毒素中,以DON毒素的产生量最多[25],其可干扰核糖体肽基转移酶的活性,从而阻碍蛋白质的合成[26]。本研究检测到的镰刀菌均为DON化学型,且大部分为15-ADON化学型。分析3-ADON和15-ADON化学型菌株的分布,发现小麦不同部位对镰刀菌毒素化学型可能并不存在选择性,小麦穗部和茎秆的镰刀菌毒素化学型基本相同,而茎基部镰刀菌毒素化学型与穗部和茎秆不同,原因可能是优势病原菌不同所造成的。除此之外,本研究在小麦茎秆上分离到一株可产生3-ADON和15-ADON两种毒素化学型的黄色镰刀菌,这一现象从未被报道,其对镰刀菌毒素产生机制的研究可能存在潜在价值。

在过去,焚烧秸秆可快速消灭病残体及其上面附着的病原菌,但随着我国对环境保护要求的提高,秸秆还田取代了曾经的焚烧秸秆。秸秆还田将秸秆营养返回田地的同时,也带来了更多的初侵染源,造成病原菌菌源量的逐年累加[27],这也成为病害监测预警模型建立的一个重要考量。本研究结果表明,禾谷镰刀菌是陕西省整株小麦的镰刀菌优势病原菌,其可同时侵染小麦穗部、茎秆和茎基部,在三个部位之间不断产生分生孢子进行再侵染;同时,秸秆还田使三个部位均为病原菌提供越冬场所,加重小麦镰刀菌病害的严重度。因此,在未来监测预警的模型建立中,不同部位的小麦镰刀菌病害可以相互结合建立,以达到更加精准的预警。本研究分析了小麦不同部位的镰刀菌种群结构和毒素化学型,为小麦镰刀菌病害的大田精确防治及动态监测预警提供了一定理论依据,但不同部位镰刀菌种群结构与气候、土壤等环境因素的具体关系,还需进一步验证。