赵海霞 刘林昊 曹盼盼

(河南省省立医院,河南 郑州 450000)

糖尿病肾病是糖尿病患者的重要并发症之一,肾小管损伤是糖尿病肾脏病变的一个重要方面,而肾小管上皮细胞凋亡和炎症是肾小管损伤产生的重要原因〔1,2〕。因此,防治糖尿病肾病的机制之一可能是阻滞高糖环境下人肾小管上皮细胞炎症因子的分泌。证据表明环状RNA(circRNA)与某些肾脏疾病的发病机制有关,可能参与多种肾脏疾病的病理过程,可以作为肾脏疾病的新生物标记〔3〕。circ溴结构域PDH指转录因子(BPTF)是衍生自BPTF外显子的新型环状RNA,研究报道敲减circBPTF通过靶向miR-384/LIN28B轴可减轻高糖诱导的人脐静脉内皮细胞的炎症性损伤和氧化应激〔4〕。敲除circBPTF可通过miR-31-5p/RAB27A轴抑制膀胱癌的进展和复发〔5〕。但circBPTF对高糖诱导的肾小管上皮细胞损伤的影响尚不清楚。microRNA已被认为是糖尿病性肾病发展的关键调节器,2型糖尿病患者中miR-98-5p表达水平降低〔6〕。miR-98-5p通过靶向Hmga2可减轻糖尿病肾病的上皮-间充质转化和肾纤维化〔7〕。且miR-98-5p过表达抑制了氧葡萄糖剥夺/复氧诱导的神经元凋亡〔8〕。miR-98-5p将脂多糖(LPS)诱导的M1巨噬细胞极化转变为M2巨噬细胞极化,并通过上调tribbles假激酶(Trib)1抑制炎症〔9〕。但目前尚不清楚miR-98-5p对高糖诱导的肾小管上皮细胞损伤的影响及其与circBPTF的靶向关系。本研究探讨circBPTF对高糖诱导的肾小管上皮细胞损伤的影响及对miR-98-5p的调控作用。

1 材料与方法

1.1材料 DMEM培养基(上海恒斐生物);肾小管上皮细胞(美国sciencell);si-circBPTF、anti-miR-98-5p、miR-98-5p及其阴性对照表达载体质粒(杭州鹰旸生物);荧光定量PCR试剂盒(上海吉玛制药);肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-6酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒〔亚科因(武汉)生物〕;蛋白提取试剂盒(美国Epigentek);凋亡检测试剂盒(日本同仁研究所);双荧光素酶报告基因检测试剂盒(美国BioAssay Systems)。

1.2细胞处理与分组 肾小管上皮细胞用含25 mmol/L葡萄糖的DMEM培养基培养,作为高糖(HG)组;用含5.5 mmol/L葡萄糖的DMEM培养基培养的细胞作为正常对照(Con)组;将si-NC、si-circBPTF、miR-NC、miR-98-5p转染至肾小管上皮细胞后,用含25 mmol/L葡萄糖的DMEM培养基培养,记为HG+si-NC组、HG+si-circBPTF组、HG+miR-NC组、HG+miR-98-5p组;将si-circBPTF分别与anti-miR-98-5p、anti-miR-NC共转染至肾小管上皮细胞后,用含25mmol/L葡萄糖的DMEM培养基培养,记为HG+si-circBPTF+anti-miR-98-5p组、HG+si-circBPTF+anti-miR-NC组。

1.3实时荧光定量-聚合酶链反应(RT-qPCR)测定circBPTF和miR-98-5p表达 用TRIzol试剂根据制造商的方案从各组细胞中提取总RNA,对于miRNA和mRNA的逆转录,分别使用miRNA逆转录试剂盒和PrimeScript逆转录试剂盒根据制造商的说明合成cDNA。在ABI 7300系统上使用SYBR Green PCR试剂盒的标准方案对miRNA和mRNA进行荧光定量PCR,分别以GAPDH和U6为内参,用2-ΔΔCt法计算circBPTF和miR-98-5p的相对表达量。

1.4ELISA检测TNF-α、IL-6水平 各组处理后收集上清液,在2 000 r/min下离心20 min。根据试剂盒说明,使用TNF-α、IL-6 ELISA试剂盒分析TNF-α、IL-6的浓度。

1.5流式细胞术测定细胞凋亡 细胞(1×106)用胰蛋白酶消化,收获并在冰冷的磷酸盐缓冲液(PBS)中洗涤,在500 μl结合缓冲液中,用5 μl的碘化丙啶(PI)和10 μl的膜联蛋白Ⅴ-异硫氰酸荧光素(Annexin Ⅴ-FITC)在黑暗中染色10 min。采用EPICS XL-MCL FACScan采集荧光信号,并用FlowJo 8.7.1软件进行分析。

1.6Western印迹评估蛋白表达 用放射免疫沉淀测定(RIPA)裂解缓冲液加蛋白酶抑制剂提取总蛋白,使用二喹啉甲酸(BCA)试剂盒定量蛋白。裂解物中的蛋白质在10%的十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)分离,电转移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上,然后在室温下在5%脱脂牛奶溶液中阻断1 h。B淋巴细胞瘤(Bcl)-2、Bcl-2相关X蛋白(Bax)和磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)一抗在4 ℃下孵育过夜,然后用相应的辣根过氧化物酶耦联的山羊抗兔二抗在室温下孵育1 h,用电化学发光(ECL)检测试剂对蛋白条带进行可视化。用ImageJ软件对蛋白片段强度进行定量。GAPDH为内参。

1.7双荧光素酶报告实验检测circBPTF和miR-98-5p的靶向关系 使用StarBase(http://starbase.sysu.edu.cn/index.php)预测circBPTF和miR-98-5p之间的潜在结合。将circBPTF的野生型(WT)和突变型(MUT)3′-UTR序列分别克隆到含有荧光素酶报告基因的pGL3启动子载体中。将肾小管上皮细胞接种到24孔板中,培养至约70%的汇合度时,用LipofectamineTM3000将miR-NC、miR-98-5p与circBPTF WT或MUT荧光素酶载体共转染。转染24 h后,收集细胞,使用荧光素酶报告基因试剂盒进行分析,将荧光素酶报告基因活性归一化为海肾荧光素酶活性。

1.8统计学分析 采用SPSS20.0软件进行t检验、单因素方差分析、LSD-t检验。

2 结 果

2.1circBPTF和miR-98-5p在高糖诱导的肾小管上皮细胞损伤中的表达 与Con组比较,HG组circBPTF表达水平显著增高,miR-98-5p表达水平显著下降(P<0.05)。见表1。

表1 circBPTF和miR-98-5p在高糖诱导的肾小管上皮细胞损伤中的表达

2.2抑制circBPTF表达影响高糖诱导的肾小管上皮细胞损伤 与Con组比较,HG组肾小管上皮细胞IL-6、TNF-α、凋亡率及蛋白Bax表达显著升高,蛋白Bcl-2表达显著下降(P<0.05);与HG+si-NC组比较,HG+si-circBPTF组IL-6、TNF-α水平、凋亡率和蛋白Bax表达显著下降,蛋白Bcl-2表达显著增高(P<0.05)。见表2、图1、图2。

1～4:Con组、HG组、HG+si-NC组、HG+si-circBPTF组;图2同图1 抑制circBPTF表达对高糖诱导的肾小管上皮细胞凋亡蛋白的影响

图2 抑制circBPTF表达对高糖诱导的肾小管上皮细胞凋亡率的影响

表2 抑制circBPTF表达对高糖诱导的肾小管上皮细胞凋亡和炎症因子的影响

2.3circBPTF与miR-98-5p结合 StarBase软件预测结果显示circBPTF与miR-98-5p具有互补的核苷酸位点。见图3。miR-98-5p与WT-circBPTF共转染的细胞荧光素酶活性显著下降(P<0.05),miR-98-5p与MUT-circBPTF共转染的细胞荧光素酶活性差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。与pcDNA组(1.00±0.06)比较,pcDNA-circBPTF组miR-98-5p表达(0.53±0.04)显著下降;与si-NC组比较(1.02±0.06),si-circBPTF组miR-98-5p表达(3.15±0.21)显著增加(F=934.888,P<0.05)。见表3。

图3 circBPTF含有与miR-98-5p互补的核苷酸序列

表3 双荧光素酶报告实验

2.4miR-98-5p过表达对高糖诱导的肾小管上皮细胞损伤的影响 与HG+miR-NC组比较,HG+miR-98-5p组IL-6、TNF-α水平、细胞凋亡率及蛋白Bax表达显著下降,蛋白Bcl-2表达显著增高(P<0.05)。见图4、表4、图5。

1～4:HG+miR-NC组、HG+miR-98-5p组、HG+si-circBPTF+anti-miR-NC组、HG+si-circBPTF+anti-miR-98-5p组;图5同图4 各组Bcl-2、Bax蛋白表达

图5 各组流式细胞术检测细胞凋亡

表4 miR-98-5p过表达对高糖诱导的肾小管上皮细胞损伤的影响

2.5下调miR-98-5p表达逆转了抑制circBPTF表达对高糖诱导的肾小管上皮细胞损伤的作用 与HG+si-circBPTF+anti-miR-NC组比较,HG+si-circBPTF+anti-miR-98-5p组IL-6、TNF-α水平、细胞凋亡率及蛋白Bax表达显著增高,蛋白Bcl-2表达显著降低(P<0.05)。见图4、图5、表5。

表5 下调miR-98-5p表达逆转了抑制circBPTF表达对高糖诱导的肾小管上皮细胞损伤的作用

3 讨 论

肾小管上皮细胞可分泌多种炎症因子进入肾间质,加重肾间质的炎症和纤维化进程,从而促进肾脏疾病的进展〔10〕。研究表明,circRNA的失调与糖尿病相关并发症的病理生理密切相关〔11〕。研究报道,circ_0003928的干扰通过miR-151-3p/膜联蛋白(Anx)a2减轻了HK-2细胞中高糖诱导的细胞凋亡和炎症〔12〕。敲除circACTR2可降低高葡萄糖诱导的近端肾小管细胞的炎症和纤维化〔13〕。本研究提示,抑制circBPTF表达可降低高糖诱导的肾小管上皮细胞凋亡和炎症反应。

研究报道,miR-98-5p通过抗凋亡和抗氧化应激保护小鼠免受脑缺血/再灌注损伤〔14〕。氧化性低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)中miR-98-5p的表达下调;敲除lncRNA OIP5-AS1通过miR-98-5p/高迁移率族蛋白(HMG)B1轴可诱导ox-LDL诱导的HUVEC细胞增殖并抑制细胞凋亡,炎症损伤和氧化应激损伤〔15〕。敲低lncRNA TTTY15可通过调节miR-98-5p/CRP轴减轻H2O2诱导的心肌细胞凋亡〔16〕。本研究说明,过表达miR-98-5p抑制了高糖诱导的肾小管上皮细胞损伤。本研究发现circBPTF靶向下调miR-98-5p表达;且下调miR-98-5p逆转了抑制circBPTF表达对高糖诱导的肾小管上皮细胞损伤的保护作用。