刘建兵 李文龙 王伟 李莉 郝敏

(山西医科大学 1第二医院妇产科,山西 太原 036000;2基础医学院医学细胞生物与遗传学教研室)

宫颈癌(CC)是全球影响妇女健康的第4大常见癌症,更是发展中国家的第2大常见癌症〔1,2〕。宫颈鳞癌(CSCC)是CC的主要类型。在认识到人乳头瘤病毒(HPV)感染是诱发CC发生的主要因素后,通过HPV的筛查和疫苗开发,CC的预防已经取得了显著成就,但是转移性和复发性CC患者的总体预后仍然很差〔3〕。MicroRNAs (miRNAs)是一段含有20～24个核苷酸的非编码RNA,能够通过干扰靶基因mRNA的稳定性及翻译而影响其表达,对60%以上的人类基因具有调控作用〔4〕。miRNA的异常表达能够调节细胞的增殖、迁移、侵袭、凋亡等行为,在癌症的发生发展中发挥着重要调控作用。miRNA的作用机制是通过与靶基因的3′非翻译区(UTR)区的靶位点结合,影响靶基因的稳定性和翻译。竞争性内源RNA(ceRNA),包含了与miRNA靶基因相同的miRNA应答元件(MRE),ceRNA分子能够与miRNA靶基因竞争性结合同一个miRNA,进而影响 miRNA 对靶基因mRNA表达与翻译的调控〔5〕。ceRNA能由lncRNA、mRNA、假基因等充当,与miRNA形成ceRNA网路,能够对细胞的功能和行为等起到调节作用,在CC的发生发展中发挥着重要调控作用〔6〕。

在肿瘤基因图谱(TCGA)数据库中,CC的RNA测序、miRNA表达数据及患者的临床信息已被收录。已有研究利用ceRNA网络分析,提示母性表达(MEG)3、具有1型血小板反应蛋白基序9的ADAM金属肽酶的反应RNA(ADAMTS9-AS)2、乙醇脱氢酶(ADH)7、退样化家族成员(VGLL)3、细胞色素P450家族26亚家族B成员(CYP26B)1、miR-141、miR-96、miR-3065、miR-330和miR-499a等在CC的发生发展中发挥着重要作用〔7～9〕。本研究拟利用生物信息学方法对癌症基因组图谱(TCGA)中收录的CSCC和癌旁组织的RNA测序数据进行差异表达miRNAs分析,通过生存分析筛选预后相关的miRNAs,并构建预后相关的ceRNA网络,从而探索CSCC预后相关miRNA的作用机制。

1 材料与方法

1.1样本信息和RNA序列分析 从TCGA数据库中下载CC患者的临床信息和RNA表达数据,并筛选CSCC患者的数据进行分析。排除标准:(1)组织学诊断不是CSCC;(2)没有完整的数据(包括性别、年龄和生存状况)。本研究共选择307个患者的临床信息纳入研究,对CSCC患者的测序数据进行合并,并在R软件中进行归一化处理。其中,miRNA、mRNA的表达数据分别包括254和252个肿瘤样本组织,对照均为3个邻近的非肿瘤样本组织。

1.2差异表达分析 R软件中的“limma”包用于分析差异表达的mRNA、lncRNA和miRNA。差异表达的mRNA和lncRNA筛选标准为|差异倍数(FC)|>2.0 和P<0.01;差异表达miRNA的筛选标准为|FC|>2.5 和P<0.01。P值经过假阳性发生率(FDR)校正。

1.3功能富集分析 使用R软件中的“ Cluster Profiler”包对差异表达的mRNA进行功能富集分析,筛选出显著水平(P<0.01)的基因本体论(GO)生物学过程和京都基因和基因组百科全书(KEGG)途径。

1.4生存分析 差异表达的miRNA与CSCC预后的相关性通过结合临床数据及使用基于Kaplan-Meier曲线的R软件中“survival”包来进行分析。

1.5ceRNA网络的构建 利用R软件中“GDCRNATools”包〔10〕构建ceRNA网络。数据库选择StarBase,ceRNA网络构建标准如下:(1)lncRNAs与mRNAs表达呈正相关,判断标准为相关系数>0.3和P<0.05;(2)lncRNAs和mRNAs具有与同一个miRNA结合的相同结合位点。利用Cytoscape3.6.1对ceRNA网络进行可视化。

2 结 果

2.1CSCC中差异表达的miRNA鉴定 CSCC中106个差异表达的miRNA,其中70个上调,36个下调。见图1。表达量上调的前5个miRNA分别为hsa-miR-205-5p、hsa-miR-944、hsa-miR-141-3p、hsa-miR-141-5p、hsa-miR-203b-3p;表达量下调的前5个miRNA分别为hsa-miR-204-5p、hsa-miR-133a-3p、hsa-miR-1-3p、hsa-miR-145-5p、hsa-miR-10b-5p。

绿点:上调的miRNA分子;红点:下调的miRNA分子图1 CSCC中差异表达miRNAs的火山图

2.2CSCC中与生存相关的差异表达miRNAs的筛选 通过生存分析发现,9个差异表达miRNA分子与CSCC预后具有相关性,分别是hsa-miR-425-5p、hsa-miR-145-3p、hsa-miR-1307-3p、hsa-miR-200c-3p、hsa-miR-142-5p、hsa-miR-145-5p、hsa-miR-155-5p、hsa-miR-210-5p、hsa-miR-142-3p。见图2。

图2 CSCC预后相关miRNA分子的筛选与分析

2.3CSCC预后相关的ceRNA网络构建 为了更好地理解预后相关差异表达的miRNA在CSCC发生发展中的作用机制,根据ceRNA的工作原理,结合miRNA靶位点的预测,成功构建出一个由5个miRNA节点(hsa-miR-425-5p、hsa-miR-200c-3p、hsa-miR-155-5p、hsa-miR-145-5p、hsa-miR-142-3p)、132个mRNA节点、44个lncRNA节点和181条边组成的lncRNA-miRNA-mRNAceRNA网络。见图3。

椭圆形代表mRNA,三角形代表miRNA,菱形代表lncRNA图3 CSCC预后相关miRNA的ceRNA网络构建

2.4CSCC预后相关ceRNA网络的GO和 KEGG分析 GO和KEGG分析发现CSCC预后相关ceRNA网络主要涉及蛋白结合、生长因子结合、转录因子的活化、DNA特异序列的结合等分子功能;质膜、细胞核等细胞组分;转录的正向调控、心脏发育、信号转导、RNA聚合酶Ⅱ启动子转录的负调控、心内膜缓冲发育等生物学过程。KEGG信号通路分析显示,该网络主要参与环磷酸鸟苷酸-蛋白激酶(cGMP-PKG)信号通路、腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)信号通路、叉头框蛋白(Fox)O信号通路等的调控。见图4。

图4 CSCC预后相关ceRNA网络的GO和 KEGG分析

3 讨 论

预后是恶性肿瘤治疗过程中非常重要的评价指标。miRNAs作为一类细胞基因表达、蛋白翻译等过程中重要调控分子,能够参与细胞癌变过程的调控,并且影响肿瘤治疗后的预后评价。本次研究中筛选获得了9个与CSCC预后密切相关的miRNAs分子。在以往研究中,这9个miRNAs分子中一些已经被发现与不同器官肿瘤的预后相关,如miR-425-5p与肝细胞癌、乳腺癌、非小细胞肺癌、CC等预后显著相关〔11～14〕;miR-142-3p与鼻咽癌、肾癌预后显著相关〔15,16〕;miR-145-3p和miR-145-5p与前列腺癌预后密切相关〔17〕;miR-142-3p与肾癌预后显著关联〔16〕;miR-200c-3p的低表达预示着胰腺导管腺癌的预后较差〔18〕;miR-1307-3p在胃癌中的表达上调能够作为预测预后评价的指标〔19〕。由此可见,这组miRNAs在不同肿瘤的发生发展中发挥着重要的调控作用,并且能够影响肿瘤预后,而本研究发现这组miRNA分子与CSCC预后密切相关,提示这些分子其中一个或几个的组合可能参与CSCC预后调控,可能作为预后评价的指标,为CSCC预后的研究提供了新的靶标,有利于CSCC预后的进一步研究。

ceRNA作为一种新的基因表达调控模式,与miRNA调控网络相比,ceRNA调控网络更为精细和复杂,通过构建ceRNA网络可能找到调控miRNA功能的影响因子。Sun等〔12〕研究表明,miR-425-5p在CC患者的癌组织、外周血中均比对照明显升高,与肿瘤的分级、分期及淋巴结转移密切相关,其高表达预示预后较差,这与本研究结果一致。但目前尚未有miR-425-5p参与CC预后调控的机制研究。本研究经过生物信息学的方法探索到miR-425-5p可能通过ceRNA网络机制实现对预后的调控。其中,AC104083.1、EPB41L4A-AS1、KLF3-AS1等15个lncRNA分子能够作为ceRNA结合于miR-425-5p,影响其对ArfGAP与FG重复(AGFG)2、色盒(CBX)6、肌动蛋白丝切蛋白(CFL)2等15个靶蛋白分子的转录与翻译,从而实现对疾病预后的调控。

在miR-200c-3p的相关研究中,Liu等〔20〕先前通过生物信息学分析表明其与CC预后显著相关,与本研究结果相吻合,本研究通过构建ceRNA网络,发现BAIAP2-AS1、EPB41L4A-AS1、FTX等26个lncRNA分子可能以ceRNA的作用方式结合于miR-200c-3p上,并且影响miR-200c-3p的靶基因ANLN、氯离子通道蛋白(ANO)6、适配器相关蛋白复合物亚基sigma(AP1S)2等105个差异表达基因的表达,从而实现对疾病预后的调控。Li等〔21〕研究显示,miR-142-3p在CC中低表达,并且与国际妇产科联盟(FIGO)分级、淋巴结转移、浸润深度显著相关,生存分析表明低表达miR-142-3p的患者具有更差的预后。但是,在本研究中,虽然miR-142-3p在CSCC中显示高表达,但是低表达miR-142-3p的患者具有更差的预后,这与先前的研究结果一致。本研究进一步发现,MAGI2-AS3、MEG3、MIR100HG等20个lncRNAs可能作为ceRNA调控miR-142-3p对ATPase肌浆/内质网Ca2+转运(ATP2A)2、BTB域和CNC同系物(BACH)2、碱性核蛋白(BNC)2等37个靶基因的作用,从而影响CSCC患者的预后。MiR-155-5p和miR-145-5p与CSCC预后的相关性尚未见报道,本研究属于首次表明其与CSCC预后的相关性,可能作为预后指标评价患者预后情况。除了发现miR-155-5p和miR-145-5p与CSCC预后相关外,本研究也找到了39个和23个lncRNAs可能分别作为miR-145-5p和miR-155-5p的ceRNA,分别调控56个和41个靶基因的表达。

综上,虽然尚缺乏实验证据,但是利用生物信息学方法筛选获得了9个可能与CSCC显著相关的miRNA分子,并且成功构建了预后相关的ceRNA网络,探索这些预后相关miRNA分子可能的作用机制,这为CSCC预后靶标的探索及影响预后作用机制的研究提供了新靶点和线索。