郑通 肖志远 汪丽丹

(锦州医科大学附属第一医院,辽宁 锦州 121000)

甲状腺癌(TC)是内分泌系统最常见的恶性肿瘤,发病率逐年上升〔1〕。其中甲状腺乳头状癌(PTC)占90%以上〔2〕。细胞衰老在肿瘤发生、发展和免疫调节中起至关重要的作用〔3〕。本研究从肿瘤基因组图谱(TCGA)数据库中下载TC数据,在特定的筛选条件下筛选出细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子(CDKN)2B基因,并对其表达进行分析,从而为筛选与PTC进展相关的基因提供理论依据。CDKN2B与CDK4-细胞周期蛋白D复合体相互作用,抑制Rb的磷酸化,从而阻止细胞周期的进展〔4,5〕。在干细胞或祖细胞的细胞衰老过程中发挥重要作用,促进机体衰老。同时,参与调控细胞周期,参与细胞增殖和肿瘤的进展〔6〕。肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)已成为一种临床相关且高度可重复的生物标志物,能够影响TC预后和对治疗的反应。肿瘤细胞与其微环境功能结合为一个整体,也称为肿瘤微环境(TME)。TME主要由肿瘤细胞、免疫细胞、基质细胞、微血管、各种细胞因子和趋化因子组成。TME中的所有成分在肿瘤发生和进展中起重要作用。其中,免疫细胞是可能影响TC临床结果的最关键集群〔7〕。本文拟分析细胞衰老基因(AGs)CDKN2B上调与TC侵袭性及免疫细胞浸润的关系。

1 资料与方法

1.1数据下载 从TCGA数据库下载TC相关RNA序列表达数据,得到并纳入58个正常组织和510个肿瘤组织。从CellAge获得与细胞衰老相关的278个人类基因。

1.2衰老相关基因的选择 使用mRNA表达谱、limma软件包和R软件(V4.1.2)中的Wilcoxon秩和检验(|log2FC |>1,FDR<0.05)来显示TC队列中表达显著不同的AGs。

1.3TCGA数据库分析CDKN2B在不同肿瘤组织中的表达 TCGA数据库下载33种癌症表达谱,对比33种癌症中CDKN2B mRNA的表达情况。

1.4CDKN2B上调在TC及癌旁组织的差异表达 检测CDKN2B在TC中mRNA表达,分析TCGA和GSCA两大数据库中CDKN2B的表达数据。使用受试者工作特征(ROC)曲线区分CDKN2B在TC组织与正常组织的表达。

1.5CDKN2B mRNA表达与临床数据的关系 使用Mexpress数据库分析CDKN2B在13个表型中的关系。包括性别、初次病理诊断时的年龄、转移部位、瘤体深度、瘤体长度、瘤体宽度、病理原发肿瘤(T)、病理区域淋巴结(N)、病理远处转移(M)、初次治疗后新的肿瘤事件初次治疗后的新肿瘤事件、组织学类型、个人终身风险辐射暴露指标、个人肿瘤癌症状态、肿瘤分期、样本类型和拷贝数。

1.6生物信息学 使用R软件中的pheatmap和ggpubr包来开发火山图、热图和使用GOplot包对46个差异表达基因进行基因本体功能注释(GO)功能富集和京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集。

1.8临床资料 收集锦州医科大学附属第一医院2019年1月至2021年1月收治的老年PTC患者标本,包括癌及癌旁配对正常甲状腺组织120例,其中男26例,女94例,年龄50～83岁。纳入标准:①所有患者未进行放化疗;②术后病理证实为PTC。排除标准:①特殊病理类型;②有TC家族遗传史。本研究经医院伦理委员会批准。

1.9主要试剂 一抗兔抗人CDKN2B(A01500-1,boster,中国)、辣根过氧化物酶(HRP)-标记山羊抗兔IgG(111-035-003,Jackson ImmunoResearch,美国)、二氨基联苯胺(DAB)显色液(DAB-1031,迈新试剂,中国)。

1.10方法 免疫组化SABC法检测CDKN2B蛋白表达。组织用10%甲醛溶液固定,脱水透明,蜡包埋,切成4 μm厚的连续切片,微波修复,3%过氧化氢孵育,血清封闭。一抗(4 ℃过夜)、依次加入二抗,DAB显色、苏木素重染、常规脱水、透明、中性黏接封口。用磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗作为阴性对照。免疫组化结果采用双盲评分法解释。结果判定:采用苏木素-伊红染色法观察免疫反应物质标记的组织切片颜色变化。将其转换为颜色地图,并计算不同级别的值。阳性结果为棕黄色颗粒沉淀,按颜色强度评分:无颜色为0分,浅黄色为1分,黄色为2分,棕黄色为3分。染色细胞百分比:所有细胞中阳性细胞百分比≤9%为0分;10%～25%为1分;26%～50%为2分;51%～74%为3分;≥75%为4分。着色强度乘以阳性细胞百分比>3时为阳性,结果分为0～2(-)、3～4(+)、6～8()和9～12()水平。

1.11统计学方法 采用R(V4.1.2)和SPSS25.0软件进行Wilcoxon符号秩和检验。

2 结 果

2.1TC中AGs的表达 对278个AGs进行分析,结果显示46个AGs都有表达差异。17个上调基因和29个下调基因,根据FDR<0.05和〔log2(FC)〕>1的标准进行鉴定(图1)。散点图显示这些肿瘤组织与非肿瘤组织的差异表达基因。见图2。

图1 TC中46AGs表达差异

图2 TC中AGs的表达

2.2CDKN2B在泛癌中的表达情况 与癌旁正常组织相比,33种癌症中21种CDKN2B显著上调。不同癌症类型中CDKN2B mRNA异常表达,见图3。

与癌旁正常组织相比:1)P<0.001,2)P<0.01,3)P<0.05;图4同图3 CDKN2B在泛癌中的表达

2.3TC患者中CDKN2B的mRNA表达 TCGA数据库中配对数据分析显示,TC组织(n=58)中CDKN2B mRNA的表达水平均明显高于癌旁正常组织(n=58,P<0.001,图4A)。非配对数据510例TC样本和58例正常样本中CDKN2B的mRNA表达水平差异显著(P<0.001,图4B);GSCA数据库中配对数据分析显示,TC组织(n=59)中CDKN2B mRNA的表达水平均明显高于癌旁正常组织(n=59,P<0.001,图4C)。

图4 CDKN2B在TC中的mRNA和蛋白表达

2.4ROC曲线分析 CDKN2B的曲线下面积(AUC)值为0.961(95%CI=0.944～0.979)。在临界值为1.945时,CDKN2B的敏感性、特异性和准确性分别为96.58%、84.53%和85.74%。阳性预测值为97.5%,阴性预测值为36.4%。见图5。

图5 CDKN2B对TC患者诊断价值ROC曲线

2.5CDKN2B mRNA表达与相关因素的关系 Mexpress数据库分析在13个表型中,CDKN2B mR-NA的表达与组织学类型、病理M、病理N、个人肿瘤癌症状况、性别、肿瘤分期、总生存时间差异有统计学意义(P<0.05)。见图6。

根据美国甲状腺协会（ATA）、美国国家癌症综合网络（NCCN）、欧洲肿瘤内科学会（ESMO）等发布的甲状腺疾病诊治指南推荐，对甲状腺结节的处理意见均以US-FANC检查结果为依据［6］。我国相关指南也提出在术前评估甲状腺结节良恶性时，US-FANC是敏感度和特异度最高的方法［7］。本研究所得病理结果的诊断敏感性98.5%、特异性85.7%，且卡方检验显示术前US-FANC和术后病理比较无显著差异。

图6 615例TC患者CDKN2B基因表达与临床资料的关系

2.6差异表达的AGs的功能富集 在GO term富集分析中这些基因明显与生长因子受体信号通路和细胞衰老信号通路相关。KEGG通路富集分析主要与细胞衰老和P53信号通路相关。见图7。

图7 差异表达的AGs GO和KEGG分析

2.7TC组织中CDKN2B的表达与免疫细胞浸润的相关性 CDKN2B的表达与中性粒细胞(r=0.526,P<0.001)、CD4+T细胞(r=0.507,P<0.001)、树突细胞(r=0.437,P<0.001)、B细胞(r=0.356,P<0.001)、巨噬细胞呈正相关(r=0.335,P<0.001)。CDKN2B与Th1细胞、Th2细胞、中性粒细胞、未成熟树突细胞、巨噬细胞相关。见图8、图9、图10。

图8 CDKN2B表达与免疫浸润水平的相关性

图9 CDKN2B表达与免疫浸润水平的相关性

图10 CDKN2B表达与免疫浸润水平的相关性

2.8PTC组织及其癌旁组织中CDKN2B蛋白阳性表达比较 免疫组织化学结果显示,CDKN2B主要定位于细胞质和细胞膜,显微镜下可见黄色或棕黄色颗粒,癌旁组织局灶呈弱表达或不表达。见图11。PTC及癌旁组织中CDKN2B表达的阳性率(67.5%和30.00%)差异显著(χ2=33.771,P<0.001)。

图11 CDKN2B在PTC组织和癌旁正常组织表达(SABC法,×200)

2.9CDKN2B表达与PTC患者临床资料相关性 本研究分析了120例PTC患者的临床相关资料,在PTC组织与癌旁组织中,CDKN2B表达与肿瘤直径≥1 cm、颈部淋巴结转移存在显著差异(P<0.05)。见表1。

表1 CDKN2B阳性表达与PTC患者临床资料相关性(n,n=120)

3 讨 论

衰老是一个具有细胞自主分泌和旁分泌效应复杂的生物过程,对微环境存在显著影响〔10,11〕。研究表明,可以通过衰老相关分泌表型激发的先天免疫和适应性免疫反应消除衰老细胞〔12〕。衰老相关分泌表型在短期内存在积极作用。然而,从长远来看,在癌症的免疫抑制背景下,这些功能也有可能会成为有害因素进而促进肿瘤发展〔3〕。随着人们对TC的深入认识,相关治疗手段也不断精进,使得PTC治疗效果明显改善,但仍存在部分PTC患者疾病进展迅速,现有治疗手段无法控制疾病进展。因此,深入研究PTC增殖相关的分子基础及信号通路,不仅可以进一步阐明PTC的发病机制,为PTC诊断和预后预测提供分子生物标志物,而且可以为分子靶向治疗提供深远的意义〔13〕。本研究结果表明,CDKN2B可能作为一个潜在的诊断生物标志物来区分PTC组织和正常甲状腺组织。CDKN2B编码的蛋白是肿瘤相关蛋白,在细胞增殖、凋亡和衰老中发挥重要作用〔14〕,有研究表明,CDKN2B过表达与胃癌预后不良有关〔15〕。Arya等〔16〕研究发现,在甲状旁腺腺瘤中,CDKN2B基因高度高甲基化,而在正常甲状旁腺组织中没有观察到这些基因的异常甲基化,表明CDKN2B 的高度甲基化促进了散发甲状旁腺肿瘤的发展。本研究结果表明,CDKN2B与细胞衰老和P53信号通路密切相关。转录因子P53作为中心枢纽,将各种应激信号转化为不同的细胞结果,如DNA修复、细胞周期停滞或细胞死亡等〔17〕。突变的P53是癌症治疗的有吸引力的药物靶点,因此,靶向消耗p53也是抑制肿瘤进展的有效策略〔18〕。

通过比较PTC组织和正常的甲状腺组织,本文发现CDKN2B的表达与中性粒细胞、CD4+T细胞、树突细胞、B细胞、巨噬细胞呈正相关关系。这些细胞类型中的大多数已在研究中报道过,且在TME中具有不同的作用,如免疫逃逸和肿瘤生长和侵袭的调节(T细胞和巨噬细胞)〔4,19〕。然而,很少有研究关注幼稚B细胞、记忆B细胞、TFH细胞和静息细胞在PTC中的作用。这些细胞也参与肿瘤的发展。如TFH细胞的浸润与乳腺癌和肺癌的存活密切相关〔20,21〕。有研究证实,CD8+T细胞和嗜中性粒细胞的浸润分别表明OS更好和更差;CD8+T细胞在DTC中表达上调,预后更好,而中性粒细胞在ATC中表达上调,预后更差〔22〕。

本研究结果初步揭示,CDKN2B在PTC中的临床意义,CDKN2B在PTC中高表达且与肿瘤直径、淋巴结转移相关。CDKN2B进一步被确定为区别PTC的肿瘤标志物,且证明与免疫浸润密切相关。本文初步发现CDKN2B可能与P53信号通路等相关,详细的调控还有待一系列功能分析进行深入验证。本研究为TC治疗提供了一种新的分子生物学标志物。然而,CDKN2B在TC发生和发展中的具体分子机制还有待于进一步研究。