孙传伟 蒋曼妃 吴煌福 王璐瑶 谭光宏

(海南医学院第二附属医院 1乳甲外科,海南 海口 570100;2全科医学科)

乳腺癌是最致命和最普遍的癌症之一,2020年全球新增226万例乳腺癌患者,占所有女性癌症新增病例的1/4,严重威胁着广大女性健康,其中人表皮生长因子受体(HER)-2阳性乳腺癌占所有乳腺癌的20%～30%,恶性程度较其他分型乳腺癌高,预后较差〔1〕。目前临床上多采用手术切除并辅以放化疗的方式治疗乳腺癌,但治疗后肿瘤的复发转移使得乳腺癌的远期生存率仍然不容乐观,因此探究乳腺癌侵袭转移的机制并找到有效的治疗靶点意义重大。近年来研究发现〔2〕,长链非编码核糖核酸(LncRNA)和微小核糖核酸(miRNA)表达谱的异常与各种恶性肿瘤的发生发展有密切关系。LncRNA FoxP4-AS1已被证实在胰腺癌、食管鳞状细胞癌和鼻咽癌等恶性肿瘤中异常表达且能够影响肿瘤细胞的多种生物学功能〔3～5〕。有多个报道指出〔6,7〕,miR-136-5p在宫颈癌、甲状腺癌等多种癌症中发挥抗肿瘤功能。迁移侵袭增强因子(MIEN)1在包括乳腺癌在内的多种恶性肿瘤中大量表达,促进肿瘤细胞的侵袭和迁移,有文献报道〔8〕,miR-136-5p与MIEN1存在着靶向作用关系。有研究显示〔9〕FoxP4-AS1在宫颈癌细胞中呈高表达水平,且能够通过靶向调控miR-136-5p表达,提高宫颈癌细胞的增殖和转移能力,然而其对乳腺癌细胞迁移、侵袭的作用仍不清楚。本研究选取HER-2阳性乳腺癌细胞株SKBR-3进行体外细胞实验,探究FoxP4-AS1靶向miR-136-5p对人乳腺癌细胞侵袭、迁移能力的影响及作用机制。

1 资料与方法

1.1细胞 人乳腺癌细胞株SKBR-3(生产批号BFN60700185,购自美国ATCC细胞库)。

1.2药物与试剂 脂质体转染试剂盒(购自美国GENMED公司,生产批号GMS10026);si-FoxP4-AS1(正义5′-CCAUCGUAUGCAAUUGA-3′,反义5′-CGUUAACGUAUAGA-3′)、pcDNA-FoxP4-AS1(正义5′-CGUAAGAUGAUAGAUA-3′,反义5′-GUAAGUA-GCAGCUAACGU-3′)、FoxP4-AS1-NC(正义5′-CC-GAUAAUGUAGCUCU-3′,反义5′-AGUAGUAGAUGCAUAAU-3′)、miR-136-5p mimic(正义5′-AGUA-UAGUCCUACC-3′,反义5′-GUGUAAUGAUCCCUAA-3′)、miR-136-5p inhibitor(正义5′-GUGAAUCAUUC CUAC-3′,反义5′-CUAAAUUAGAUAUACGG-3′)、miR-NC(正义5′-UGAAUGCUAUCAUUG-3′,反义5′-AAUGCUAUAUCAAC-3′)、野生型和突变型荧光素酶报告载体(Luc-3′UTR-WT/MUT)及引物(由上海赛百盛公司合成);结晶紫染液(购自上海康朗生物科技有限公司,生产批号KL805211);;双荧光素酶报告基因检测试剂盒(生产批号D0010,购自北京索莱宝)兔抗人MIEN1、基质金属蛋白酶(MMP)9、E-钙黏蛋白(E-cadherin)、β肌动蛋白(β-actin)单克隆及羊抗兔多克隆抗体(生产批号PA1-1110、PA1-830、PA5-11393、PA3-031A、PA5-27188、PA5-27192、PA5-11722、PA5-20126,购自美国Invitrogen公司)。

1.3实验器材 BC 190型CO2培养箱,瑞士SALVIS;alpha 300S型光学显微镜,自德国WITec;Revolve Generation 2型荧光显微镜(购自美国ECHO公司);3422型Transwell小室(购自美国Owens Corning公司);S1000TMDual 48 Well型聚合酶链反应(PCR)仪(购自美国BIO-RAD公司);Biosens 850型凝胶成像系统,上海山富科学仪器有限公司;EPS-300型电泳仪,韩国Lab Companion。

1.4细胞培养、转染和分组 SKBR-3细胞在DMEM培养基中培养,添加100 U/ml青霉素、100 μg/ml链霉素和10%胎牛血清(FBS),培养箱条件37 ℃、5%CO2。取对数生长期的SKBR-3细胞,细胞悬液于96孔板(5.0×105个细胞/孔)中,37 ℃、5%CO2培养2 h。细胞分别转染si-FoxP4-AS1(FoxP4-AS1下调组)、pcDNA-FoxP4-AS1(FoxP4-AS1上调组)、FoxP4-AS1-NC(FoxP4-AS1对照组)、miR-136-5p inhibitor(miR-136-5p下调组)、miR-136-5p mimic(miR-136-5p上调组)、miR-NC(miR对照组),根据制造商的说明采用脂质体转染法转染。另以未转染的SKBR-3细胞为空白组,每组设置6个复孔。48 h后,在光学显微镜和荧光显微镜下拍照计数,测定转染效率。

1.5Transwell测定侵袭、迁移能力 分别取各组人乳腺癌细胞株SKBR-3用胰蛋白酶消化,磷酸盐缓冲液冲洗,使用无血清培养基重悬,调整密度为1×105个/ml。在Transwell小室上室(预先用基质胶覆盖)中加入200 μl细胞悬液,下室加500 μl 10%血清培养基。常规培养24 h,用棉签擦去基质胶和上室中未迁移细胞,磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗,用4%多聚甲醛固定30 min,弃固定液后加入结晶紫染液染色10 min,用自来水冲洗膜,干燥,然后在光学显微镜下观察和计数细胞。对于迁移实验,无需在Transwell上室膜孔用基质胶提前覆盖,其余步骤同上。

1.6实时逆转录聚合酶链反应(RT-qPCR)测定FoxP4-AS1、miR-136-5p表达及MIEN1、E-Cadherin、MMP-9信使核糖核酸(mRNA)表达 分别取各组人乳腺癌细胞株SKBR-3,RT-qPCR检测各目的基因mRNA的表达。FoxP4-AS1上游引物5′-CGTTAGACAGCAGCA-3′,下游5′-TGTAACGGATACGC-3′,产物长度136 bp;miR-136-5p上游引物5′-TGACGATGAGTAACG-3′,下游5′-GTCAATGTAGATGTAC-3′,产物长度184 bp;MIEN1上游引物5′-TTACGTAGTAGCCAC-3′,下游5′-GACCGTAGTACGTAAC-3′,产物长度155 bp;E-cadherin上游引物5′-TAAGTCGTAGTATCCAGTC-3′,下游5′-CTGAATGCCTGTAAG C-3′,产物长度214 bp;MMP-9上游引物5′-AGTGTAGTACGTACGTATG-3′,下游5′-AGTCCTAGTATGCCTAAC-3′,产物长度259 bp;U6上游引物5′-TTAACGTAGAGCTCTGACC-3′,下游5′-CGAGATGC TTAACCGT-3′,产物长度104 bp;β-actin上游引物5′-TGCCTAGTAGCTCGTAGA-3′,下游5′-CCGTAGTAGCTCGTAAG-3′,产物长度301 bp。除miR-136-5p(U6为内参)的其余基因以β-actin为内参,用2-ΔΔCt法计算各基因表达。

1.7Western印迹测定MIEN1、E-cadherin、MMP-9蛋白表达 分别取各组人乳腺癌细胞株SKBR-3,使用细胞裂解液从各组细胞提取总蛋白,Bradford法测定蛋白浓度。蛋白样品经电泳分离,然后转移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上,用5%脱脂牛奶阻断膜1 h,与一抗(1∶2 000)抗体在4 ℃孵育过夜。次日,与辣根过氧化物酶(HRP)耦联的二抗(1∶5 000)在室温下孵育2 h,显色反应,Biosens 850型凝胶成像系统分析处理。以β-actin为内参,通过ImageJ软件分析蛋白条带灰度值。

1.8双荧光素酶报告基因实验验证FoxP4-AS1与miR-136-5p的靶向关系 TargetScan miRNA靶基因预测软件(https://www.targetscan.org/vert_80/)用来预测FoxP4-AS1与miR-136-5p的结合位点。使用PCR扩增miR-136-5p与FoxP4-AS1的结合片段。随后,将扩增产物插入Luc-3′UTR-WT载体,构建野生型报告基因(野生型FoxP4-AS1)。对结合片段进行定点诱变以构建一个FoxP4-AS1突变体报告基因(突变型FoxP4-AS1)。接下来,用重组报告质粒和miR-136-5p mimics或miR-NC共转染SKBR-3细胞。转染后48 h,收集细胞,使用双荧光素酶报告试剂盒检测荧光素酶活性。以萤火虫荧光素酶与海肾荧光素酶活性的比值代表荧光素酶相对活性。

1.9统计学分析 采用SPSS25.0软件进行方差分析和SNK-q检验。

2 结 果

2.1各组细胞转染效率 FoxP4-AS1对照组、FoxP4-AS1下调和上调组、miR对照组、miR-136-5p下调和上调组转染效率分别为(90.41±3.15)%、(85.92±1.83)%、(87.70±2.26)%、(85.44±1.61)%、(91.26±2.27)%、(88.52±1.42)%,见图1。

图1 各组细胞转染效率(×100)

2.2各组细胞FoxP4-AS1、miR-136-5p表达、MIEN1、E-cadherin、MMP-9 mRNA及蛋白表达 与空白组和FoxP4-AS1对照组比较,FoxP4-AS1下调组miR-136-5p表达、E-cadherin mRNA及蛋白表达明显升高,FoxP4-AS1表达、MIEN1、MMP-9 mRNA及蛋白表达明显降低(P<0.05);FoxP4-AS1上调组miR-136-5p表达、E-cadherin mRNA及蛋白表达明显降低,FoxP4-AS1表达、MIEN1、MMP-9 mRNA及蛋白表达明显升高(P<0.05),与空白组和miR对照组比,miR-136-5p下调组miR-136-5p表达、E-cadherin mRNA及蛋白表达降低,FoxP4-AS1表达、MIEN1、MMP-9 mRNA及蛋白表达升高;miR-136-5p上调组miR-136-5p、E-cadherin mRNA及蛋白表达明显增加,FoxP4-AS1表达、MIEN1、MMP-9 mRNA及蛋白表达下降(P<0.05),见图2、表1。

表1 各组细胞FoxP4-AS1、miR-136-5p表达及MIEN1、E-cadherin、MMP-9 mRNA及蛋白表达

1～7:空白组、FoxP4-AS1对照组、FoxP4-AS1下调组、FoxP4-AS1上调组、miR对照组、miR-136-5p下调组、miR-136-5p上调组图2 各组细胞MIEN1、E-cadherin、MMP-9蛋白表达

2.3各组细胞侵袭、迁移能力 与空白组和FoxP4-AS1对照组比较,FoxP4-AS1下调组的侵袭、迁移细胞数目明显下降,FoxP4-AS1上调组侵袭、迁移细胞数目明显升高(P<0.05)。与空白组和miR对照组比较,miR-136-5p下调组侵袭和迁移细胞数目明显升高,miR-136-5p上调组侵袭和迁移细胞数目明显降低(P<0.05),见图3、表2。

表2 FoxP4-AS1及miR-136-5p表达对各组细胞侵袭和迁移细胞数的影响个,n=6)

图3 各组侵袭和迁移细胞数(结晶紫染色,×200)

2.4FoxP4-AS1靶向调控miR-136-5p验证 TargetScan数据库提示miR-136-5p和FoxP4-AS1之间存在潜在的结合位点因,见图4。miR-136-5p mimic组转染野生型FoxP4-AS1细胞的荧光素酶相对活性明显低于miR-NC组(P<0.05);miR-136-5p mimic组转染突变型FoxP4-AS1细胞的荧光素酶相对活性与miR-NC组相比差异无统计学意义(P>0.05),见表3。

表3 荧光素酶相对活性比较

图4 FoxP4-AS1与miR-136-5p之间的结合位点

3 讨 论

乳腺癌的发病是遗传和环境共同作用的结果,其中包括年龄、月经及生育情况、性激素水平、压力、肥胖、抽烟酗酒等多种因素〔10〕。目前临床上多采用手术、放疗、化疗及内分泌治疗等方法治疗乳腺癌,但存在不良反应较大、易复发转移等问题〔11〕。近年来,分子靶向药物的出现为治疗HER-2阳性乳腺癌提供了新的方向,因此有关乳腺癌的发病机制和治疗靶点的研究亦成为近几年的研究热点。

本研究结果提示,FoxP4-AS1在乳腺癌细胞的侵袭迁移中起促进作用,miR-136-5p在乳腺癌细胞的侵袭迁移中起抑制作用。有研究显示〔12〕,FoxP4-AS1在胃癌中高表达,敲低FoxP4-AS1表达可阻碍胃癌细胞增殖,抑制其侵袭、迁移和血管生成。另有报道指出〔13〕,LncRNA FAM83H-AS1通过抑制miR-136-5p的表达促进三阴乳腺癌细胞的侵袭、迁移和增殖,与上述研究相一致。

本研究提示,FoxP4-AS1可提高MIEN1、MMP-9的表达,降低miR-136-5p、E-cadherin表达,而miR-136-5p可下调MIEN1、MMP-9表达,上调E-cadherin表达。双荧光素酶实验结果证实了FoxP4-AS1可直接靶向调控miR-136-5p,因此合理推测FoxP4-AS1可能是通过靶向抑制miR-136-5p来促进MIEN1、MMP-9的表达,抑制E-cadherin的表达进而实现增加乳腺癌细胞侵袭迁移能力的作用的。FOXP4-AS1可通过推进肿瘤细胞周期转变,促进细胞增殖〔14〕。Li等〔15〕发现,FOXP4-AS1在结直肠癌患者肿瘤组织中呈显著高表达,且表达量与患者预后较差有密切关系。MIEN1是近几年新发现的一种促癌基因,在多种恶性肿瘤中通过增强肿瘤细胞的上皮间充质转化(EMT)促进细胞的侵袭和迁移〔16〕。E-cadherin是EMT的重要标志之一,E-cadherin下调可导致细胞间黏附性降低,细胞由上皮样转化为间质样〔17〕。MMP-9主要通过降解细胞外基质抑制肿瘤细胞间的黏附性,诱导肿瘤细胞浸润、转移〔18〕。有研究发现〔19〕,FoxP4-AS1能够通过靶向调控miR-136-5p的表达,促进结直肠癌细胞的增殖、侵袭和迁移,加快癌症进展,本研究结果与该研究相一致。