王贵军 于天宇 邓蓓蓓

(锦州医科大学附属第一医院 1普外科,辽宁 锦州 121000;2采血室)

胃癌是全球第五大恶性肿瘤,其死亡率在所有癌症排名中居第三位〔1〕。尽管临床诊疗策略有所改善,但由于肿瘤复发风险高,预后较差,胃癌患者总生存期并未得到明显改善。探索胃癌进展的分子机制,识别有效的分子标志物和治疗靶点,对提高胃癌患者生存率至关重要。非编码RNA(ncRNA)表达异常与胃癌进展关系密切,环状RNA(circRNA)可与靶微小RNA(miRNA)结合,拮抗miRNA对其下游靶基因的抑制作用,从而调控胃癌细胞增殖、转移等恶性表型〔2,3〕。hsa_circ_0000069表达增加与结直肠癌患者的临床病理特征相关,敲低hsa_circ_0000069可抑制结直肠癌细胞周期进展和体外增殖、迁移能力〔4〕。hsa_circ_0000069高表达预示宫颈癌患者预后较差,下调hsa_circ_0000069表达对宫颈癌进展具有抑制作用〔5〕。靶基因预测显示miR-548c-3p是hsa_circ_0000069的潜在靶点。miR-548c-3p已被报道参与多种肿瘤过程,miR-548c-3p通过调节细胞增殖和凋亡来改善乳腺癌进展〔6〕。miR-548c-3p还介导下调hsa_circ_0101145对肝癌细胞的迁移和生长抑制作用〔7〕。然而,hsa_circ_0000069和miR-548c-3p在胃癌中的表达和作用并不清楚。本研究首先分析了胃癌中hsa_circ_0000069和miR-548c-3p表达水平,并从细胞增殖、周期分布、凋亡角度探讨hsa_circ_0000069靶向miR-548c-3p在胃癌进展中的作用。

1 材料与方法

1.1胃癌组织 收集2018年3月至2019年10月在锦州医科大学附属第一医院确诊并接受手术治疗49例,胃癌患者的癌组织和对应癌旁组织,其中男31例,女18例,年龄32～75岁,平均(57±5.65)岁,所有标本立即置于液氮中冷冻,后在-80 ℃保存直至RNA提取。所有参与者同意使用其组织样本。本研究经医院伦理审查委员会批准。

1.2细胞和试剂 人胃癌细胞系SNU-1、AGS、HS-746T和正常胃黏膜细胞GES-1购自中国科学院上海细胞库;Trizol试剂、PrimeScript逆转录试剂盒购自大连Takara公司;SYBR Green荧光定量染料法试剂盒购自美国ABI公司;si-hsa_circ_0000069、pcDNA-hsa_circ_0000069、miR-548c-3p mimics、anti-miR-548c-3p及各组的阴性对照(si-NC、pcDNA、miR-NC、anti-miR-NC)购自广州锐博生物公司;细胞计数试剂盒(CCK-8)购自上海索宝生物科技公司;膜联蛋白Ⅴ-异硫氰酸荧光素(Annexin Ⅴ-FITC)凋亡检测试剂盒购自上海爱必信生物公司;兔源剪切型半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Cleaved-caspase)-3单克隆抗体(AC033)、兔源β-actin单克隆抗体(AF5003)、辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(A0208)购自上海碧云天生物公司。

1.3细胞培养 SNU-1、AGS、HS-746T、GES-1细胞均接种添加10%胎牛血清、1%青链霉素溶液的RPMI1640培养基中,置于37 ℃、含5%CO2温箱孵育。细胞80%融合时,胰酶消化后1∶3传代。

1.4RT-qPCR检测hsa_circ_0000069、miR-548c-3p表达 采用TRIzol试剂从采集的49对组织样本和细胞中提取总RNA,测定浓度和纯度后,用PrimeScript逆转录试剂盒反转录为cDNA,再用SYBR Green法进行RT-qPCR。引物序列:hsa_circ_0000069上游5′-CTACTTCAGGCACAGGTCTTC-3′,下游5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′;β-actin上游5′-CGTGACATTAAGGAGAAGCTG-3′,下游5′-CTAGAAGCATTTGCGGTGGAC-3′;miR-548c-3p上游5′-ACACTCCAGCTGGGCAAAAATCTCAAT-3′,下游5′-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3′;U6上游5′-CTC GCTTCGGCAGCACA-3′,下游5′-AACGCTTCA-CG AATTTGCGT-3′。2-ΔΔCt法计算hsa_circ_0000069、miR-548c-3p表达量。

1.5实验分组 将对数期SNU-1细胞接种24孔板,在细胞50%融合时用Lipofectamine2000将siRNA、miRNA mimics、anti-miRNA、pcDNA等转染到细胞中,收集转染48 h细胞,RT-qPCR检测hsa_circ_0000069或miR-548c-3p水平验证转染效果。根据转染寡核苷酸或质粒不同,共分为si-NC组、si-hsa_circ_0000069组、miR-NC组、miR-548c-3p组、pcDNA-hsa_circ_0000069组、pcDNA组、si-hsa_circ_0000069+anti-miR-NC组、si-hsa_circ_0000069+anti-miR-548c-3p组。未转染的SNU-1细胞记为对照(NC)组。

1.6CCK-8法检测细胞活力 将转染48 h SNU-1细胞接种96孔板,贴壁后在每孔中加入10 μl CCK-8试剂,并进一步孵育细胞2 h。用分光光度计在450 nm处测量吸光度(A)以表示细胞活力。

1.7流式细胞仪检测细胞凋亡和周期分布 用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤转染48 h SNU-1细胞两次,800 r/min离心5 min,弃上清,加490 μl预冷结合缓冲液重悬细胞,加入5 μl Annexin V-FITC和5 μl 碘化丙啶于细胞悬液中,轻轻混匀。将试管置于冰上,避光孵育10 min,流式细胞仪检测细胞凋亡。收集转染48 h SNU-1细胞,800 r/min离心5 min,弃上清收集细胞沉淀。用预冷PBS洗涤两次,加入预冷75%乙醇在4 ℃固定5 h。1 500 r/min离心5 min,弃上清,PBS洗涤细胞后,加入400 μl碘化丙啶和100 μl RNase A于4 ℃避光孵育30 min。用细胞周期拟和软件ModFit分析结果。

1.8Western印迹检测Cleaved-caspase-3蛋白表达 用RIPA裂解液提取转染48 h SNU-1细胞总蛋白,用10%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳分离,转移到聚偏二氟乙烯膜上。用5%脱脂乳阻断后,用Cleaved-caspase-3、β-actin一抗在4 ℃孵育膜过夜。用TBST缓冲液洗涤后,将酶标二抗稀释,室温孵育膜1 h。化学发光检测试剂显色,Image Lab软件对目的蛋白表达进行定量。

1.9双荧光素酶报告实验 合成与含有miR-548c-3p预测靶位点的hsa_circ_0000069野生(WT)序列或具有预测靶位点的突变(MUT)序列,并将其克隆到pGL3载体中获得重组载体hsa_circ_0000069-WT、hsa_circ_0000069-MUT。用Lipofectamine2000试剂将miR-548c-3p mimics、miR-NC分别与hsa_circ_0000069-WT或hsa_circ_0000069-MUT共转染。48 h后裂解细胞,测定相对荧光素酶活性。

1.10统计学方法 采用SPSS22.0软件进行统计分析。每次检测设置3个重复,实验独立进行3次。采用独立样本t检验确定两组数据差异,采用单因素方差分析和SNK-q检验分析多组数据差异。

2 结 果

2.1胃癌组织中hsa_circ_0000069和miR-548c-3p表达情况 胃癌组织中hsa_circ_0000069表达水平(2.51±0.23)显著高于癌旁组织(1.00±0.14;t=39.256,P<0.05),miR-548c-3p表达水平(0.43±0.06)显著低于癌旁组织(1.00±0.16;t=23.350,P<0.05)。

2.2胃癌细胞系中hsa_circ_0000069和miR-548c-3p表达情况 胃癌细胞SNU-1、AGS、HS-746T中hsa_circ_0000069表达水平(2.34±0.20,2.07±0.19,1.93±0.15)显著高于人正常胃黏膜上皮细胞GES1(1.00±0.11;F=110.190,P<0.05),miR-548c-3p表达水平(0.41±0.04,0.51±0.05,0.50±0.04)显著低于GES1细胞(1.00±0.09;F=186.174,P<0.05)。选择表达差异较大的SNU-1细胞进行实验。

2.3下调hsa_circ_0000069抑制SNU-1细胞增殖、周期进展,诱导凋亡 与NC组比较,si-hsa_circ_0000069组SNU-1细胞hsa_circ_0000069表达水平、A值、S期细胞比例显著降低,Cleaved-caspase-3蛋白表达、G0/G1期细胞比例、凋亡率显著升高(均P<0.001),见图1、表1。

表1 下调hsa_circ_0000069表达对SNU-1细胞增殖、周期分布、凋亡的影响

1～3:NC组、si-NC组、si-hsa_circ_0000069组图1 下调hsa_circ_0000069表达对SNU-1细胞凋亡、Cleaved-caspase-3蛋白表达的影响

2.4上调miR-548c-3p表达抑制SNU-1细胞增殖、周期进展,诱导凋亡 与miR-NC组比较,miR-548c-3p组SNU-1细胞miR-548c-3p表达水平、Cleaved-caspase-3蛋白表达、G0/G1期细胞比例、凋亡率显著升高,A值、S期细胞比例显著降低(均P<0.001),见图2、表2。

表2 上调miR-548c-3p表达对SNU-1细胞增殖、周期分布、凋亡的影响

图2 上调miR-548c-3p表达对SNU-1细胞凋亡、Cleaved-caspase-3蛋白表达的影响

2.5hsa_circ_0000069靶向调控miR-548c-3p表达 Circular RNA Interactome预测到hsa_circ_0000069序列含有与miR-548c-3p特异性结合位点,见图3。同与hsa_circ_0000069-WT共转染时,转染miR-548c-3p可降低细胞相对荧光素酶活性(P<0.05);同与hsa_circ_0000069-MUT共转染时,转染miR-548c-3p对细胞相对荧光素酶活性无显著影响,见表3。si-hsa_circ_0000069组SNU-1细胞hsa_circ_0000069表达水平显著低于si-NC组,miR-548c-3p表达水平显著高于si-NC组(P<0.05);pcDNA-hsa_circ_0000069组SNU-1细胞hsa_circ_0000069表达水平显著高于pcDNA组,miR-548c-3p表达水平显著低于pcDNA组(P<0.05),见表4。

表3 相对荧光素酶活性检测

表4 RT-qPCR检测miR-548c-3p的表达

图3 Circular RNA Interactome预测miR-548c-3p和hsa_circ_0000069的靶向关系

2.6抑制miR-548c-3p表达可以逆转下调hsa_circ_0000069对SNU-1增殖、周期分布、凋亡的影响 与si-hsa_circ_0000069+anti-miR-NC组比较,si-hsa_circ_0000069+anti-miR-548c-3p组SNU-1细胞miR-548c-3p表达水平、Cleaved-caspase-3蛋白表达、G0/G1期细胞比例、凋亡率显著降低,A值、S期细胞比例显著升高(均P<0.001),见图4、表5。

表5 抑制miR-548c-3p表达可以逆转下调hsa_circ_0000069对SNU-1增殖、周期分布、凋亡的影响

1～2:si-hsa_circ_0000069+anti-miR-NC组、si-hsa_circ_0000069+anti-miR-548c-3p组图4 抑制miR-548c-3p表达可以逆转下调hsa_circ_0000069对SNU-1细胞凋亡及Cleaved-caspase-3蛋白表达的影响

3 讨 论

circRNA是广泛存在于真核生物细胞的单链RNA,其表达丰富、性质稳定,在癌症进展的各个生物学过程中均发挥重要作用。研究显示,胃癌中circ_0026344低表达与淋巴结转移、浸润深度、总生存期等显著相关〔8〕。胃癌中circ_0008035表达增加,沉默circ_0008035可抑制胃癌细胞增殖,诱导细胞凋亡和铁死亡〔9〕。circ_0023642、circ_006100等circRNA高表达可促进胃癌肿瘤形成和转移〔10,11〕。然而,circRNA在胃癌中的功能和调控机制在很大程度上仍是未知的。本研究结果提示,hsa_circ_0000069可能参与胃癌进展。研究指出,hsa_circ_0000069高表达与胰腺癌患者较低的总生存率相关,下调hsa_circ_0000069表达可诱导胰腺癌细胞凋亡和周期阻滞,抑制其增殖和转移〔12〕。在宫颈癌中hsa_circ_0000069通过与miR-4426特异性结合促进肿瘤细胞增殖和迁移〔13〕。本研究结果提示,hsa_circ_0000069在胃癌中起着致癌因子作用,下调hsa_circ_0000069通过抑制细胞增殖、周期进展、诱导细胞凋亡来抑制胃癌进展。

miR-548c-3p表达水平是评价骨肉瘤良恶性水平的重要参考指标,上调miR-548c-3p表达可促进骨肉瘤细胞凋亡〔14,15〕。miR-548c-3p通过抑制缺氧诱导的因子(HIF)1α介导的血管内皮生长因子(VEGF)信号通路调控乳头状甲状腺细胞活力和迁移能力,抑制肿瘤进展〔16〕。miR-548c-3p还可抑制胶质瘤细胞增殖和迁移〔17〕。本研究与前人〔17〕报道的抗肿瘤作用吻合。既往研究显示,circRNA、lncRNA等ncRNA可与miRNA结合并抑制miRNA功能,如circ_0001017可抑制致癌因子miR-197表达来抑制胃癌细胞增殖和转移〔18〕;LINC00266-1通过靶向下调miR-548c-3p诱导骨肉瘤细胞增殖和转移〔19〕。本研究结果表明,hsa_circ_0000069通过靶向负调控miR-548c-3p进而参与胃癌进展。然而,本研究仅进行了体外细胞实验,仍需开展动物实验进一步验证hsa_circ_0000069靶向miR-548c-3p在胃癌中的作用。