王培 何元 侯蕾娜

(陕西省肿瘤医院麻醉科,陕西 西安 710061)

术后认知功能障碍(POCD)是指在患者在麻醉苏醒的一段时间内,轻者表现为记忆损害或健忘综合征〔1〕,对指令反应变迟缓,严重者会丧失判断能力和语言概括能力,甚至导致人格改变,患者记忆力、注意力、理解力受损,给患者和家人带来极大的不良影响〔2〕。若POCD持续时间过长,可能会导致患者社会活动、生活能力降低甚至丧失〔3〕。异氟烷是常用的新型全身吸入麻醉药,诱导期较短,常用于小手术或者复合麻醉,极易引起麻醉过深,虽然在使用过程中给患者和医务人员带来很多便利,但难免会导致POCD出现〔4〕。过往研究发现,银杏叶提取物对大脑、心脏和血脑屏障等组织器官具有保护作用〔5〕。未有研究直接证明银杏叶提取物对POCD有改善作用,本实验旨在研究银杏叶提取物对异氟烷麻醉下的大鼠的认知功能和神经功能的影响。

1 材料与方法

1.1研究动物 选取40只8月龄SPF级Wistar大鼠,体质量206～232 g,购置来源:杭州环特生物科技股份有限公司,动物许可证号:SCXK(浙)2022-0003,所有大鼠在无菌、相对湿度50%、室温24 ℃的恒温箱中进行喂养,饮用水为超纯水、所食用食物均经过高温消杀,适应性喂养7 d。本实验操作均符合动物实验伦理要求的相关规定,经医院伦理委员会批准同意。

1.2分组与给药 分组与建模:适应性喂养7 d后,选取大鼠40只,按照随机分法,10只作为空白组,以朱霞等〔6〕大鼠模型为参照,其余30只大鼠均注射6%异氟烷(鲁南贝特制药有限公司生产;国药准字H20020267)进行麻醉处理,麻醉3.5 h,根据情况适当追加麻醉。造模成功后,将30只大鼠分为建模组、抵抗组、治疗组,各10只。给药:治疗组给予20 mg/kg银杏叶提取物和100 mg/kg生理盐水腹腔注射,抵抗组注射50 mg/kg银杏叶提取物和100 mg/kg生理盐水,空白组和建模组注射50 mg/kg二甲基亚砜和100 mg/kg生理盐水,给药48 h后进行相关指标检测。

1.3逃逸潜伏期和记忆时间 Morris水迷宫实验:对各组进行Morris水迷宫实验训练,使用直径110 cm,高45 cm的水池,于第三象限设置一个直径10 cm的平台,隐于水下。将大鼠在象限中央放入大鼠,训练大鼠寻找第三象限平台,进行相关训练。定位航行训练:4组大鼠连续训练7 d,训练时,将大鼠从池壁4个位点放入水中(水温保持恒定24 ℃),训练大鼠找到隐藏第三象限的水下隐蔽平台,大鼠能够找到并在平台站立的时间为逃避潜伏期。每只大鼠每天从4个入水点分别训练1次,持续4 d,每次间隔时间为1 min。从第5天开始视为大鼠完成训练,持续进行强化训练,直至7 d完成。每组选取5只大鼠进行实验。

1.4旷场实验分析 分别于麻醉后1 d和2 d同时间进行旷场实验分析,使用120 cm×120 cm×50 cm的黑色无盖聚乙烯塑料箱,平均分为9格。每次放入一只大鼠于中央箱格内,自由探索10 min。

采用自动图像监视系统自动追踪和记录大鼠运动路程,并记录大鼠行为和在中央格停留时间。每只大鼠检测完成后,场地均进行消杀和痕迹去除。

1.5大鼠海马组织病理形态观察 进行行为实验后,每组随机抽取一只大鼠,予以麻醉处理,断头、去除颅骨,取出脑组织,于低温快速剥离海马组织,将海马组织置于3%戊二醛固定液中低温冷藏备用。于低温快速剥离海马组织,将低温处理的海马组织研磨均匀,1 500 r/min处理3 min。将冷藏的海马组织使用70%丙酮处理15 min后,再次使用90%丙酮做二次处理,重复两次上述步骤;将脱水处理后的海马组织聚合固化为包埋块,经后续处理后,使用超薄切片机切割出40 nm的切片,放置于载网,使用滴染液(醋酸铀、硝酸铅)染色10 min。将处理后的海马组织切片用透射电镜观察,拍摄海马组织结构形态。

1.6海马组织氧化应激反应检测 使用酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒处理,将上文所得海马组织溶液稀释,放入孵育箱37 ℃温育30 min,使用显色剂处理,450 nm波长观察吸光值,检验溶液中谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、谷胱甘肽(GSH)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)含量。

1.7Western印迹法检相关蛋白 取大鼠海马组织研碎之后,加入300 μl裂解液,混合均匀,低温静止1 h,以3 500 r/min离心10 min后,收集上层清液。将获得的溶液采用二喹啉甲酸(BCA)检测法,加热使蛋白质变形,再次离心10 min,取上层清液待检。每孔上样分离胶与浓缩胶60 μl,100 V恒压电泳2 h,待溴酚蓝达到胶底部时,停止操作。将蛋白转移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜,使用脱脂奶粉封闭转印膜,TBST洗3次,2 min/次。加入核磷蛋白(c-FOS)、血清蛋白(SP)孵育。使用辣根过氧化物酶耦联二级抗体山羊抗兔IgG室温再次孵育,将其放入电化学发光(ECL)工作液中,使其显色,成像系统对光密度进行分析B淋巴细胞-2基因相关X蛋白(Bax)的蛋白表达水平。

1.8统计学处理 采用SPSS19.0软件进行方差齐性检验、重复测量的方差分析。

2 结 果

2.1逃逸潜伏期和记忆时间 如表1所示,与空白组相比,模型组、抵抗组、治疗组第4、5、7天潜伏逃逸时间变长、记忆时间缩短,具有统计学差异(P<0.05);与模型组相比,抵抗组、治疗组第4、5、7天潜伏逃逸时间较短,记忆时间较长,具有统计学差异(P<0.05);与治疗组相比,抵抗组第4、5、7天潜伏逃逸时间较短,记忆时间较长,具有统计学差异(P<0.05)。

表1 各组逃逸潜伏期和记忆时间

2.2旷场实验 如表2所示,与空白组相比,模型组、抵抗组、治疗组第1、7天停留时间变长、站立次数和跨格次数减少,具有统计学差异(P<0.05);与模型组对比,抵抗组、治疗组第1、7天停留时间较短、站立次数和跨格次数较多,具有统计学差异(P<0.05);与治疗组对比,抵抗组第1、7天停留时间较短、站立次数和跨格次数较多,具有统计学差异(P<0.05)。

表2 各组旷场实验比较

2.3大鼠海马组织病理形态观察 如图1所示,空白组海马CA1区神经元结构清晰完整,排列整齐,细胞呈极性排列分布;模型组海马CA1区神经元结构分散,数量减少,排列紊乱无序,大部分细胞皱缩,部分细胞核固缩,细胞染色质异常;相比较模型组,抵抗组和治疗组CA1区神经元结构较为清晰,细胞排列整齐,少部分染色质异常,小部分细胞核固缩;相比较治疗组,抵抗组海马CA1区神经元结构更清晰紧凑,排列更清晰,染色质变异较少。

图1 各组海马组织病理形态(HE染色,×200)

2.4海马组织氧化应激指标检测 如表3所示,与空白组对比,模型组、抵抗组、治疗组GSH-Px、SOD、GSH表达降低,MDA表达上升,具有统计学差异(P<0.05);与模型组对比,抵抗组、治疗组GSH-Px、SOD、GSH表达升高,MDA表达降低,具有统计学差异(P<0.05);与治疗组对比,抵抗组GSH-Px、SOD、GSH表达较高,MDA表达较低,具有统计学差异(P<0.05)。

表3 各组氧化应激指标及海马组织Keap1、Nrf2、ARE mRNA相对表达水平比较

2.5Western印迹法检测Keap1、Nrf2、ARE、Bax蛋白表达情况 如表3、图2所示,与空白组相比,模型组、抵抗组、治疗组脑组织Keap1、Bax、ARE表达升高,Nrf2表达降低,具有统计学差异(P<0.05);与模型组相比,抵抗组、治疗组Keap1、Bax、ARE表达降低,Nrf2升高具有统计学差异(P<0.05);与治疗组相比,抵抗组Keap1、Bax、ARE表达升高、Nrf2表达降低,具有统计学差异(P<0.05)。

图2 Western印迹检测Keap1、Nrf2、ARE、Bax 蛋白表达

3 讨 论

吸入性麻醉是指挥发性麻醉药物经过呼吸道,以气体的方式吸入肺内,由肺泡进入血液循环而达到中枢神经系统,抑制中枢神经从而暂时使机体意识、感觉、反射等部分张力减弱或消失的一种麻醉方法〔7〕。

异氟烷是常用的吸入性麻醉药,适用于全身麻醉,麻醉效力小于付完和甲氧氟烷〔8〕。由于其麻醉深度容易控制,在临床常用于小手术和脑部手术〔9〕。相关研究证实异氟烷作为全麻药对患者的认知行为具有损害作用〔10〕。银杏叶提取物具有广泛生物学效应,对脑细胞具有保护和恢复作用〔11〕。

水迷宫实验通过强迫实验动物游泳,学习寻找隐藏在水中平台的实验,用来测验实验动物对空间位置和空间定位的学习能力〔12〕。研究证明,水迷宫实验中大鼠潜伏逃逸时间说明大鼠学习能力和认知能力,大鼠找到水中平台和对环境的感知能力和海马区有关〔13,14〕。大鼠海马体积变小,导致创伤后应激障碍和记忆障碍〔15〕。本研究验证了针对异氟烷所产生的POCD症状,银杏叶提取物可以改善患者不良症状,对受伤害的海马区保护和恢复具有正向效能。旷场实验是将动物放置在一个封闭的平面区域中,观察行为和活动的实验〔16〕。从动物在划分区域中活动的次数和轨迹分析动物神经紧张度〔17〕。相关研究表明,站立行为反映动物对新环境的适应情况和自身的兴奋程度〔18〕。跨格次数反映的是对环境的探索程度〔19〕。中央停留时间反映大鼠对周围环境的认知能力〔20〕。本研究说明,银杏叶提取物对POCD大鼠的认知能力和记忆能力有保护和恢复效果,且存在较好保护能力。

认知功能障碍的病理进程和脑部蛋白的沉积及自由基氧化反应有关〔21〕。氧化应激状态下,海马组织发生氧化应激反应导致神经元凋亡,进而导致认知功能障碍〔22〕。研究表明,GSH-Px是机体内广泛存在的一种重要的过氧化物分解酶〔23〕。GSH是一种含γ-酰胺键和巯基的三肽,具有抗氧化作用〔24〕。SOD又称超氧歧化酶,MDA是过氧化反应的产物,机体内丙二醛上升则表示机体过氧化反应剧烈〔25〕。本研究说明,银杏叶提取物有助于降低机体内过氧化反应,对POCD预防和治疗有较好效果。

Keap1-Nrf2/ARE分为两部分,一部分在细胞质,一部分在细胞核。Nrf2与上游Keap1特异性结合,Nrf2活性受到抑制,促进其激活进入细胞核内,并与抗氧化反应元件结合。相关研究表明,Bax可促使细胞器释放出某些信号分子,在这些信号分子作用下半胱氨酸蛋白酶活化,进而拮抗B细胞淋巴瘤-2的抗凋亡效应而使细胞趋于凋亡,或者作用于线粒体膜,降低线粒体膜电位,使线粒体通透性转变孔(MPTP)开放,线粒体膨胀,使细胞进入凋亡程序进而诱导细胞凋亡〔26〕。Keap1-Nrf2/ARE通路是抗氧化应激的核心通路之一,Keap1是重要阻遏蛋白,与Nrf2结合后存在于细胞质中,当机体发生氧化应激时,Nrf2被激活与Keap1接力,转移至细胞核内,与ARE对应位点结合,进而提升细胞抗氧化能力,促进细胞凋亡。本研究说明,银杏叶提取物有效减轻机体氧化应激反应,减少海马组织细胞萎缩和染色质变异,提升大鼠记忆能力和认知能力。