陈辉 袁钰 蒋涛

(安徽中医药大学第二临床医学院推拿科,安徽 合肥 230061)

动脉粥样硬化(AS)是由脂质堆积于动脉内膜而引起的慢性炎症反应性疾病,主要发生在人体的大中动脉内〔1〕。此病的早期症状并不明显,而当病理改变引起动脉狭窄至一定程度后,可引起持续的缺血症状。人体的脑组织需氧量较高且新陈代谢较快,主要依靠脑内动脉摄取能量〔2〕。颈内动脉(ICA)和椎动脉(VA)是脑内的主要供血动脉。其中ICA上行入颅内后分为大脑前动脉和大脑中动脉,主要负责脑前部的血液供给。因此,AS及其硬化斑块引起动脉狭窄是引起脑梗死等缺血性脑血管疾病的关键因素。同时,若斑块在外因作用下脱落、破裂,可形成栓子继而引起心血管栓塞等严重不良事件〔3〕。中医学理论认为,老年人脾肾亏虚,精血不足,因而经脉失濡养,阳气衰微而无力化湿,湿邪积于体内而化热,内邪阻滞经络而致经络不同,形成此证。随着老龄化加剧及高脂血症、糖尿病等基础病的发病率逐年升高,AS的发病率也逐年增加。

推拿疗法是基于中医学理论,运用特定手法作用于特定部位或穴位,以达到治疗或预防疾病目的的疗法,其中颈椎旋转疗法是一种临床中常用的脊柱推拿疗法,通过旋转颈椎、推动棘突等操作以达到松解颈部关节和肌肉、进而缓解疼痛等治疗目的〔4,5〕。但颈椎的生理结构较为薄弱,更易发生损伤,部分患者经治疗后会出现一过性低血压、眩晕等不良反应,因此颈椎旋转治疗的安全性,也是近年争论的焦点。临床中部分经颈椎旋转手法治疗后出现不适的患者多数都存在AS,如何安全地对AS患者进行颈椎旋转手法治疗及颈椎旋转手法是否会引起血流动力学改变及其他不良反应,是本研究的重点。

随着影像学技术和实验动物学等学科的发展,可实现对AS斑块进行载体动态观测〔6〕。本研究拟通过构建家兔颈动脉斑块形成模型,观察颈椎旋转手法对其血流剪切力、相关细胞因子分泌水平的影响,为优化临床中颈椎旋转手法治疗方案、提升其安全性积累基础。

1 材料和方法

1.1实验动物 选取成年雄性3月龄新西兰兔40只,体质量2 000～2 500 g,由湖南太平生物科技有限公司提供。许可证号:SCXK(湘)2020-0005。家兔均单笼饲养,适应性饲养1 w。环境温度为(23±1)℃,湿度<70%,环境噪声小于60 dB,12 h光暗周期。每2 w对饲养笼进行清洗。饲养方法依据各组实验方案,自由饮水。

1.2主要实验仪器及试剂 小动物彩超(IU22,飞利浦电子),脱水机(JT-12J,武汉俊杰电子),病理切片机(RM2016,上海莱卡仪器),包埋机(JB-L5,武汉骏杰电子),光学显微镜(NIKON ELIPSE CI,上海普赫光电科技);球囊扩张导管(爱德华生命科学),磷酸盐缓冲液(PBS)、二氨基联苯胺(DAB)显色剂,生理盐水、戊巴比妥钠溶液、碘伏消毒液、青霉素注射液、无菌纱布、无菌手术单、可吸收缝合线(江苏豪森药业),兔白细胞介素(IL)-6试剂盒、兔IL-1β试剂盒、Masson染色试剂盒(Solarbio)高脂饲料(金牧阳实验动物)。

1.3实验方法

1.3.1动物模型及分组 将40只家兔依照随机数字表法分为对照组(5只)、模型组(5只)及实验组(30只),实验组又分为颈椎旋转90 °组(A组,10只),颈椎旋转105 °组(B组,10只),颈椎旋转120 °组(C组,10只)。选用ICA内皮拉伤联合高脂饲料喂养法构建ICA斑块形成动物模型。适应性饲养后,除对照组以外,家兔均进行造模,术前12 h禁食,使用3%戊巴比妥钠溶液,依照22.5 mg/kg剂量对家兔进行麻醉。麻醉后将家兔固定于手术台,将左侧颈总动脉区域消毒并剃毛,沿着颈总动脉走行切开皮肤,将颈内外动脉及颈总动脉剥离,使用血管钳于颈总动脉分叉上方1.5 cm处的颈内外动脉、颈总动脉分叉处下方3 cm结扎,于颈外动脉结扎处下方0.5 cm剪一小口,将球囊经此插入ICA,使用注射器向内注射空气使球囊扩张,抽插3次后将球囊抽出,随后于切口下方结扎动脉,解除血管钳后密切观察,无出血情况即可缝合皮肤,注射80万U青霉素防止感染,每日1次,共3次。对照组家兔正常喂养(120 g/d),其余家兔采用高脂饮食喂养(92%普通饲料+2%胆固醇+5%猪油+1%蛋黄粉,120 g/d),连续饲养8 w。

1.3.2动物模型检测 实验组家兔饲养8 w后,选用颈动脉彩超检验模型是否制备成功。将家兔麻醉后固定为仰卧位,充分暴露颈部并消毒剃毛,使用动物彩超机将探头与颈总动脉呈30 °夹角,从气管内侧纵起扫描至颈总动脉分叉处及ICA,沿ICA走行向头侧移动,随后将探头转动90 °后沿血管走行扫描纵切面和横截面,观察记录左侧ICA内膜厚度及斑块形成情况。若斑块形成且管腔狭窄程度≥70%,则模型制备成功〔7〕。

1.3.3颈椎旋转手法干预 剔除模型制备失败的家兔,实验组家兔进行颈椎旋转手法治疗。参考人体颈部推拿操作方法:将家兔置于蹲坐位,安抚至安静后,以滚法、弹拨法、一指禅法放松颈部肌肉,随后将其颈部前屈约15 °,拇指和食指置于头颈部,掌心置于后颈处,另一手托住下颌,双手向上牵拉并反向旋转,角度依次为90、105、120 °,每周治疗3次,连续治疗2 w。

1.3.4实验指标 (1)血流动力学指标检测:手法治疗结束后,取各组家兔耳缘静脉血,倒置振荡5 min后,于2 h内检测血液黏滞度(η),同时计算血流剪切力(τm),τm=血液黏滞度×4×平均血流速度/左颈总动脉血管舒张末期管腔直径。(2)血清细胞因子水平检测:血清收集方法同上。选用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测样本中IL-6、IL-1β、单核细胞趋化蛋白(MCP)-1水平。选用兔IL-6、IL-1β、MCP-1试剂盒进行检测,严格遵循试剂盒说明书进行操作。(3)颈总动脉形态学观察:干预结束后,以空气栓塞法将各组家兔处死,取左侧颈总动脉,室温下以PBS冲洗干净并剥离脂肪和筋膜,4%甲醛溶液固定后,脱水,透明,石蜡包埋后切片,将一半的切片进行Masson染色。严格依照Solarbio试剂盒操作说明进行染色操作制作切片。每个切片选出3个视野进行拍照,使用Image-Pro Plus软件计算视野中的纤维帽厚度/脂质核比值。(4)颈总动脉黏附因子水平比较:选用免疫组化法检测各组家兔颈总动脉血管细胞黏附因子(VCAM-1)、细胞间黏附因子(ICAM)-1水平。将石蜡切片使用3%过氧化氢溶液除去过氧化物酶,滴加非免疫动物血清后静置20 min,加入一抗后,PBS冲洗,随后加入二抗,冲洗后加入ABC复合物,随后进行DAB显色,在镜下观察后,使用MIAS图像系统进行分析,统计染色阳性细胞在视野内的比例。

1.4统计学方法 采用SPSS22.0软件进行单因素方差分析、秩和检验。

2 结 果

2.1造模结果 造模后,共有6只造模失败,其中模型组1只、A组2只、B组1只、C组2只,其余均造模成功。颈动脉彩超可见左侧ICA的管腔狭窄,管壁普遍增厚,可见强回声。对照组家兔左侧ICA经超声检查后,示动脉管未见管腔狭窄或斑块,血管壁厚度均一。

2.2血流动力学指标 造模后各组血液黏滞度显著升高,而血流剪切力显著下降(P<0.05),治疗后,A、B、C组血液黏滞度和血流剪切力均明显下降且低于模型组,同时随着旋转角度增加,血液黏滞度增加而血流剪切力下降,差异具有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 各组血流动力学及血清IL-6、IL-1β、MCP-1水平、Masson染色结果比较

2.3各组血清IL-6、IL-1β、MCP-1水平比较 制备ICA斑块模型后,各组的炎性因子水平均显著升高,A、B、C组IL-6、IL-1β、MCP-1水平明显低于模型组,同时经治疗的A、B、C组家兔的炎性因子水平显著下降,A组低于B组,B组低于C组,差异具有统计学意义(P<0.05)。见表1。

2.4Masson染色结果 如图1所示,Masson染色将肌原纤维染为淡红色或红色,细胞核染为黑蓝色,胶原纤维染为蓝色。各组均可见斑块的形成,且模型组更为明显。同时造模后,各组斑块胶原含量/斑块面积比值均显著下降(P<0.05),A、B、C组比值较模型组显著增加(P<0.05),且随颈椎旋转角度增加而显著升高(P<0.05)。见表1。

图1 各组左颈总动脉(Masson染色,×100)

2.5各组VCAM-1、ICAM-1水平 制备ICA斑块模型后,各组黏附因子水平均显著升高(P<0.05),A、B、C组VCAM-1、ICAM-1水平明显低于模型组,且A组低于B组,B组低于C组,差异具有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 各组VCAM-1、ICAM-1水平比较

3 讨 论

颈动脉血管粥样硬化是弥漫性血管病理性改变,主要表现为随年龄增长而加重的炎性反应和增生,广泛发生于全身的动脉中,严重危害老年人群的生命健康。颈椎旋转疗法是临床中常用于颈部治疗的手法,可通过旋转颈部关节达到松解肌肉、降低肌张力、缓解疼痛的作用,但其安全性一直是争议的焦点〔8〕。有学者指出,在对患者进行颈椎旋转治疗前需进行安全性评估,其中合并颈动脉斑块就是一项关键的危险因素。

颈动脉斑块模型有大鼠、小鼠、家兔及猪等,家兔由于体型适中,是常用的动物模型〔9〕。本研究选用高脂喂养联合球囊拉伤造模法,诱导颈动脉发生粥样化病变,彩超检测结果也验证了模型制备方法的可靠性。

血流剪切力是指血管中血液在血液黏滞度的作用下,对血管内壁和内皮细胞产生的摩擦力,与动脉粥样硬化的形成密切相关〔10〕。有研究表明,持续的血流剪切力下降可能引起血管内皮功能受损,可导致粥样硬化斑块形成,同时影响斑块的分布〔11〕。本研究结果提示,斑块形成后的血流动力学病理性改变,颈椎旋转手法能够有效改善颈动脉斑块形成,颈椎旋转手法角度过大可能减弱手法治疗效果,引起斑块的稳定性降低。

IL-1β由内皮细胞和活化的巨噬细胞产生,可通过增加血管通透性、刺激血管内皮细胞增殖等途径,进而加剧血管内膜增生、血管壁受损,促进血栓的形成〔12〕。IL-6是常用的炎性标记物,可通过促进调节血小板源性生长因子的水平进而加速斑块的形成,同时也可反映机体的炎性水平,MCP-1是一种趋化因子,参与单核细胞与炎性细胞的活化和迁移,通过加强细胞间黏附,使单核细胞聚集于血管受损处,侵入内皮后分化为巨噬细胞,进一步AS的发生和发展〔13,14〕。本研究结果提示,颈椎旋转手法能够有效通过下调炎性反应水平进而发挥治疗作用,颈椎旋转手法角度过大可能降低手法的治疗效果,促进斑块形成后家兔颈动脉处的炎性反应和血管壁受损,进而促进斑块的形成。

AS斑块由纤维帽斑块和脂质核心构成,纤维帽厚度与脂质核心的面积影响着斑块的稳定性。研究表明,随着脂质核心面积的增加,斑块稳定性下降,更易发生破裂,极易引起心血管并发症〔14,15〕。本研究结果提示,颈椎旋转手法能够有效改善斑块的稳定性,颈椎旋转角度过大可能降低斑块不稳定,加速其破裂。

VCAM-1、ICAM-1主要表达于内皮细胞表面,属于免疫球蛋白。在动脉发生粥样硬化病变的过程中,血管内皮受损,黏附因子等活性物质会引起内核细胞和单核细胞的黏附并进入内皮,吞噬脂质最终演变为泡沫细胞,加速粥样硬化斑块的形成〔16〕。内皮细胞在多种因素刺激下表达活性升高,上调ICAM-1表达,增加了内皮细胞与白细胞之间的黏附,加剧炎性反应,同时脂质过氧化会引起VCAM-1过表达〔17〕。本研究表明,颈椎旋转角度过大,可能导致血管和细胞间的黏附上调进而加剧内皮的损伤程度,降低治疗效果。

同时本研究也存在一定的不足。首先由于实验条件的限制,本研究的样本量较小,研究结果较为局限,未来可扩大样本量,增强研究结果的可信度,降低误差。其次由于解剖结构的差异性,家兔的颈部结构与人体具有较大差异,因此家兔所用推拿治疗手法与人体的安全性仍需进一步验证。本研究仅对颈椎旋转手法的角度进行了探究,未能对手法作用的力量、速度及治疗频率和治疗时长进行对比,同时由于斑块形成是长期的病理作用结果,后续研究中可考虑增加不同时间点对照组,以观察颈椎旋转疗法的长期影响。

综上,颈椎旋转手法可能通过调节炎性反应和黏附因子水平等途径改善颈动脉斑块,但随着颈椎旋转角度增加,可能降低手法的治疗效果。