宋鹏程 赵卫国 王明丽 宋长军 赵学荣 王宏业 王响 杨凤爱 李炳茂

(衡水市人民医院中医科,河北 衡水 053000)

幽门螺杆菌(Hp)相关胃炎主要是由Hp定植于胃黏膜后引起患者出现胃痛、恶心、口腔异味、胃胀等症状。西药技术主要采用铋制剂、质子泵抑制剂及抗生素联用的方法帮助患者清除脏器黏膜中的Hp,但是,该疗法疗程长,疗效不稳定,毒副作用如呕吐、乏力等问题突出〔1〕,因此临床上急需需要一种安全、高效、不良反应少的药物来控制疾病的恶化。中医药技术在治疗慢性胃炎、Hp感染相关胃炎等消化系统疾病方面具有价格低廉,疗效显著、不易复发等优势。中医临床医师认为〔2〕,Hp为疫毒外邪,不仅影响脏器功能,并可导致机体正气损伤,气机失司,血行不畅,脾失运化,胃失和降,气滞化热,水蕴成湿,因此脾胃湿热型是Hp相关胃炎最为常见的分型。因此中医临床医师在“健脾益气,清热祛湿”的指导下,形成了灭幽汤、芪连温胆汤、健脾化瘀解毒方等一系列的方剂,用于疾病的临床治疗,显示了良好的疗效〔3〕。黄连胃舒汤主要由黄连、黄芪、元胡、蒲公英、紫苏、白芍等中药组成,具有祛湿健脾,理气升阳等效用。郑泉〔4〕临床研究报道将黄连胃舒汤用于Hp相关胃炎的治疗,能有效清除Hp,不良反应少,但是未将其中的机制阐明。细胞自噬是一种维系自身内环境稳态的自我保护机制。在疾病的初期,能够帮助细胞抵抗不良刺激,延缓细胞凋亡,但是过度的自噬可能导致细胞中线粒体肿胀,呈现空泡样变性,加速细胞的凋亡,影响脏器的结构与功能〔5〕。Wang等〔6〕研究显示,Hp感染胃黏膜后,激活胃黏膜上皮细胞的自噬,诱导细胞异常凋亡,促进Hp的大面积定植。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)通路是一条重要的内源性的自噬相关通路。张高炼等〔7〕研究显示,激活mTOR的表达能明显抑制脑缺血再灌注损伤大鼠的神经元细胞的自噬,但是该通路在Hp相关胃炎中的作用表达较少。本研究探讨黄连胃舒汤对Hp相关胃炎脾胃湿热型小鼠胃黏膜的保护作用。

1 材料和方法

1.1试验动物、主要试剂及仪器 雄性,BALB/c小鼠,6～8周龄,体质量(19±2)g,购自北京华阜康生物科技股份有限公司,生产许可证SCXK(京)2020-0004。在湿度为45%～55%,温度20～22 ℃,条件下的动物房中进行明暗各12 h交替的适应性喂养,实验动物均自由摄食与进水,单笼饲养。本研究以获取医院动物伦理委员会的审核批准。

黄连胃舒汤中的黄连(100 g)、黄芪(100 g)、元胡(50 g)、蒲公英(100 g)、紫苏(50 g)、白芍(100 g)均由医院的中药房提供,中药的抓取及煎煮均有专门药剂人员负责,并且煎煮好的中药汤药放置在专门的冰箱里备用。

mTOR-inhibitor和mTOR-inhibitor-NC均由北京中科基因技术有限公司设计完成。Hp悉尼菌株购自中科院微生物研究所(北京)。苏木素-伊红(HE)染色试剂盒、TUNEL试剂盒、封闭液、Western印迹试剂盒(北京索莱宝生物科技有限公司),兔抗mTOR和微管相关蛋白1轻链3-β(LC3)抗体(北京中杉金桥生物科技有限公司)。

切片机(上海巴玖实业有限公司),X71光学显微镜(日本Olympus公司),低温冷冻冰箱(青岛海尔股份有限公司),Universal Hood Ⅱ凝胶成像处理系统(美国Bio-rad公司),垂直电泳仪(北京六一仪器厂),Philips 201透射电子显微镜(荷兰Eindhoven公司)。

1.2动物模型的复制及分组处理 根据段继昌等〔8〕介绍的方法进行脾虚湿热证型造模:造模动物每日以80%基础饲料、12%猪油、8%蜂蜜配置的高脂高糖饲料进行喂养,并在湿度(70±5)%,温度(30±3)℃,每日光照时长在12 h内,进行饲养,连续28 d。观察小鼠的体质量、饮水与摄水,皮毛状况。当小鼠出现精神萎靡不振,倦怠嗜卧,皮毛暗淡缺乏光泽度,枯黄脱落,不思饮食,体质量增加明显减缓,大便不成形,时干时稀等表现时,视为造模成功。

根据张鑫龙等〔9〕介绍的方法进行Hp感染胃炎造模:将Hp菌株浓度调整为0.5×1010pfu/ml备用。在脾虚湿热症型造模14 d时,将小鼠禁食12 h后以Hp菌进行灌胃,每次灌胃0.3 ml,两次灌胃时长间隔48 h,灌胃结束4 h后恢复饮食,灌胃3次后,随机处死两只小鼠,剥离小鼠的胃窦组织,进行瑞-姬氏染色,观察Hp定植情况,在光镜下,可观察到杆状的幽蓝色Hp分布在胃黏膜上皮细胞表面视为造模成功。

将小鼠随机分为正常组、模型组、黄连胃舒汤组(药物组)、mTOR-inhibitor组(抑制剂组),每组10只,其中正常组在造模过程中以正常饲料喂养,并以生理盐水灌胃。经评判造模成功后,药物组小鼠每日以500 mg/kg黄连胃舒汤灌胃2次,并腹腔注射5×109pfu/ml的mTOR-inhibitor-NC 1次,抑制剂组小鼠每日以500 mg/kg黄连胃舒汤灌胃2次,并腹腔注射5×109pfu/ml的mTOR-inhibitor 1次;正常组和模型组每日等剂量的生理盐水灌胃2次,并腹腔注射5×109pfu/ml的mTOR-inhibitor-NC 1次,连续处理14 d。

1.3黄连胃舒汤对小鼠胃排空的影响 在实验过程中,每日记录实验动物的精神状态、进食与饮水量,活动量,粪便与皮毛状况。末次给药结束4 h后,以0.8 ml半固体营养糊100 g进行灌胃,15 min后处死小鼠,在无菌操作台上剖腹,将小鼠的胃贲门、胃幽门结扎,以滤纸吸干水分,称胃全重,然后通过手术剪沿胃大弯剖开胃体,洗去胃壁附着物,滤纸吸干水分,称胃净重,小鼠的胃排空率(%)=〔1-(胃全重-胃净重)/半固体营养糊质量〕%,同时将小鼠的胃组织封存待测。

1.4黄连胃舒汤对小鼠胃组织中Hp定植的影响 取小鼠的胃组织,常规固定,石蜡切片,瑞-姬氏染色,经脱水、透明后,封片,上镜观察,同时随机选定5个视野进行Hp计数,并根据平均光密度值统计分析Hp的定植状况。

1.5黄连胃舒汤对小鼠胃组织组织病理学的影响 取小鼠的胃组织,多聚甲醛固定,石蜡包埋,梯度无水乙醇脱水,制成3～5 μm的切片,HE染色,二甲苯透明,封片,镜检。

1.6黄连胃舒汤对小鼠胃组织超微结构影响 取小鼠胃组织,戊二醛固定1 h,磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤3次,锇酸再固定90 min,脱水,包埋,切片,醋酸铀-柠檬酸铅双染色,Philips 201透射电子显微镜下观察,拍照。

1.7黄连胃舒汤对小鼠胃组织的细胞凋亡的影响 取小鼠的胃组织,常规固定,梯度无水乙醇脱水,漂洗,20 μg/ml的Tris-HCL蛋白酶K消化,PBS洗涤,TUNEL染色,室温孵育,清洗后,封片,ImageJ图像软件测定TUNEL阳性细胞的比例。

1.8黄连胃舒汤对小鼠胃组织中自噬标志蛋白LC3表达 取小鼠的胃组织,经甲醛固定,石蜡切片,脱蜡,梯度乙醇脱水,抗原修复,牛血清白蛋白封闭,依次加入一抗(1∶200)、二抗(1∶1 000),PBS洗涤,苏木素复染,封片后,显微镜下观察,视野中出现棕黄色颗粒表示目的蛋白表达。

1.9黄连胃舒汤对小鼠胃组织中mTOR和LC3表达水平 取小鼠的胃组织,在4 ℃裂解液中放置30 min,离心,并将上清液稀释,常规方法提取样本中的总蛋白,以50 μg样品进行上样,电泳后,转模,封闭,加入一抗(1∶1 000),二抗(1∶5 000)稀释后,室温孵育后,显色30 min,以GAPDH为参照,分析目标蛋白的灰度值。

1.10统计学分析 采用SPSS16.0软件进行单因素分析,两两比较用t检验,采用Graphpad8.0作图。

2 结 果

2.1各组实验过程中的一般状态和胃排空率的变化 在实验过程中,各组未出现死亡的现象。正常组精神状态良好,每日活动量未见异常,皮毛柔顺且有光泽,进食、饮水与大小便未见异常,体质量明显增加;模型组出现精神萎靡不振,皮毛暗淡,稀疏无光泽,疲乏嗜卧,喜欢蜷缩,反应迟钝,摄食与进水量明显下降,肛温升高,大便稀软,气味较臭,小便黄浊,体质量增加较为缓慢;药物组和抑制剂组较模型组的临床症状明显改善;但抑制剂组的改善程度较药物组明显变差。与正常组相比,模型组、药物组、抑制剂组胃排空率明显降低(均P<0.05);与模型组相比,药物组、抑制剂组胃排空率明显升高(均P<0.05);与药物组相比,抑制剂组胃排空率明显降低(均P<0.05),见表1。

表1 各组胃排空率、Hp定植的积分光密度值、LC3阳性细胞的比例、mTOR和LC3相对表达量比较

2.2各组胃黏膜中Hp定植的比较 与正常组相比,模型组、药物组、抑制剂组Hp定植的积分光密度值明显升高,定植的Hp菌量明显增多(均P<0.05);与模型组相比,药物组、抑制剂组Hp定植的积分光密度值明显降低,定植的Hp菌量明显减少(均P<0.05);与药物组相比,抑制剂组Hp定植的积分光密度值明显升高,定植的Hp菌量明显增多(P<0.05),见表1、图1。

图1 各组胃黏膜上Hp的定植(瑞-姬染色,×400)

2.3各组胃组织的损伤病理变化 HE染色显示,正常组的胃黏膜全层结构清晰,上皮细胞排列整齐致密,主细胞和壁细胞数量丰富,胃腺管、胃小凹等清晰可辨,黏膜各层细胞未见炎性浸润;模型组胃黏膜全层明显变薄,上皮细胞数量锐减,部分壁细胞呈现空泡样变性,胃腺管数量减少,排列紊乱,黏膜层可见炎性细胞大量浸润;药物组胃黏膜全层趋于正常,胃小凹、胃腺管排列趋于正常;抑制剂组胃黏膜的病理损伤较药物组缓解程度较差,胃小凹间隙增宽,胃腺管排列较为紊乱,见图2。

图2 各组胃组织损伤病理(HE染色,×400)

2.4各组胃组织的超微结构损伤变化 正常组胃黏膜细胞排列整齐,结构清晰可辨,胞核呈圆形,染色质形态稳定,胞质中细胞器数量丰富,线粒体的嵴结构清晰可辨,内质网及核糖体形态稳定的分布在胞核周围;模型组胃黏膜主细胞肿胀严重,核仁较大,线粒体明显扩张,嵴结构溶解或消失明显,内质网及核糖体数量明显减少;药物组胃黏膜超微结构损伤明显缓解,线粒体肿胀程度减小,嵴结构损伤减轻;抑制剂组胃黏膜的超微结构损伤明显加重,见图3。

图3 各组胃组织损伤的超微结构(电镜,×10 000)

2.5各组胃组织的细胞凋亡 与正常组相比,模型组、药物组、抑制剂组胃组织中细胞凋亡率明显升高(均P<0.05);与模型组相比,药物组、抑制剂组胃组织中细胞凋亡率明显降低(均P<0.05);与药物组相比,抑制剂组胃组织中细胞凋亡率明显升高(P<0.05),见表1、图4。

图4 各组胃组织细胞凋亡(TUNEL染色,×400)

2.6各组胃组织中LC3的表达 与正常组相比,模型组、药物组、抑制剂组胃组织中LC3阳性细胞的比例明显升高(均P<0.05);与模型组相比,药物组、抑制剂组胃组织中LC3阳性细胞的比例明显下降(均P<0.05);与药物组相比,抑制剂组胃组织中LC3阳性细胞的比例明显升高(P<0.05),见表1、图5。

图5 各组胃组织中LC3的表达(免疫组化,×400)

2.7小鼠胃组织中mTOR和LC3的表达 将LC3对应的基因ATG4和mTOR输入依次输入String数据库(网址:https://string-db.org/)中得到,结果显示mTOR和LC3之间存在较为复杂的调控网络,mTOR能调控LC3表达,见图6;Western印迹结果显示,与正常组相比,模型组、药物组、抑制剂组胃组织中mTOR表达明显降低,LC3表达明显升高(均P<0.05),与模型组相比,药物组、抑制剂组胃组织中mTOR表达明显升高,LC3表达明显降低(均P<0.05),与药物组相比,抑制剂组胃组织中mTOR表达明显降低,LC3表达明显升高(均P<0.05),见表1、图7。

图6 mTOR和LC3的相互作用网络

图7 各组胃组织中mTOR和LC3表达

3 讨 论

流行病学研究显示〔10〕,世界上将近50%的人因感染Hp而遭受消化系统疾病的困扰,并且随着速食主义的兴起,Hp感染率呈现逐年递增的趋势,如不能控制疾病的蔓延,极易导致溃疡性胃炎,萎缩性胃炎,肠化生,甚至是癌变等恶性事件的发生;国际上,世卫组织将Hp列为第一类致癌因子〔11〕。Hp感染诱导的胃黏膜损伤的分子机制尚未完全阐明,西医药的治疗手段不能使患者免于疾病的困扰。因此深入揭示疾病的病理机制,积极开发新型、高效的药物成为该领域学者急需解决的问题之一。

伴随历史的发展,我国中医药在治疗慢性、萎缩性胃炎方面积累了丰富的经验。而Hp相关性胃炎在中医中归为“胃痛”“痞满”,Hp为外邪入侵,以致机体脾胃正气不足,湿热内生,因此中医从清除湿热,益阳扶正角度帮助机体更好的抵抗病菌的侵入,增强胃黏膜内源性祛邪的能力。谭华梁等〔12〕临床研究结果显示,胃热舒丸通过健脾理气,清除燥热缓解Hp相关性胃炎患者的口苦口臭、恶性等临床症状,显示了良好的疗效,并且不易反复发作。黄连胃舒汤为我院治疗“胃痛”的常用方剂。黄连可泻除胃火,白芍则能止痛护肝,蒲公英可消肿散结,黄芪则理气健脾,紫苏行气宽中,本方剂能起到健脾护胃、扶正祛邪等效用〔13〕。胃排空率是胃功能监测的重要治疗,而治疗Hp相关性胃炎,最重要的是祛除Hp,减少病菌的定植〔14〕。本研究结果证实了药物对疾病的干预作用。

在正常生理条件下,细胞自噬用于清除受损的线粒体,维系细胞的稳态。Feng等〔15〕研究报道在机体处于感染Hp状态下,胃黏膜上皮细胞的自噬被过度激活,导致上皮细胞大量凋亡,并且激活相关炎性通路,帮助Hp更好的定植与大面积侵袭。Zhang等〔16〕研究显示,抑制胃黏膜上皮细胞的自噬行为,缓解Hp相关性胃炎患者的疼痛,减少病菌的定植。mTOR通路是与细胞自噬行为密切相关的通路,是干预自噬相关疾病的可靠治疗靶点〔17〕。本研究结果发现,注射mTOR-inhibitor后,抑制剂组小鼠的临床症状,胃黏膜病理损伤及超微结构损伤因药物的改善情况均被逆转,证实了药物对疾病的作用靶点。

综上,黄连胃舒汤能激活mTOR通路,抑制Hp相关性胃炎脾胃湿热证模型小鼠的细胞自噬,减轻胃黏膜组织损伤,下调细胞的凋亡率。但是如何将该方剂推广至疾病的临床治疗,仍需结合患者的个体情况及病情进展状况,进行方剂的加减,确保每位患者获得满意的治疗效果。