王敏 罗菁 邓晶 谢环 李晓兰

(1武汉市第一医院,湖北 武汉 430022;2宜昌市第二人民医院(三峡大学第二人民医院))

临床上对于宫颈癌的判断最早起源于20世纪65年代,其是女性泌尿、生殖系统常发的恶性肿瘤病症,患者罹患宫颈癌后需及时重视起来,避免病症恶化〔1〕。据某些研究报道〔2〕,现当下我国宫颈癌患者基数逐年升高,因此宫颈癌成了临床妇科研究的重中之重。据某些研究认为〔3〕,患者在宫颈癌治疗期间往往会存在不同程度适应不良等表现,可能会导致病情恶化状况发生,进而影响治疗结局。微小RNA-135a-5p(miR-135a-5p)在恶性肿瘤组织中呈高度表达,尤以宫颈癌最为明显〔4〕。据某些研究报道〔5〕,miR-135a-5p是结构高度保守的蛋白质,在测验宫颈癌过程中起到至关重要的作用,其亦可用来表达严重程度、TNM分期、肿瘤转移状况等宫颈癌临床特征。本研究探讨沉默miR-135a-5p对患者机体病灶组织内宫颈癌细胞增殖影响、侵袭效率,并研究其主要作用机制。

1 对象与方法

1.1材料 人宫颈癌HeLa细胞(购自上海信裕生物科技有限公司,货号:HeLa,品牌:ATCC),本研究过程经医院伦理委员会批准。RPMI 1640由(北京伊塔生物科技有限公司提供,货号:YT8432;胎牛血清由广州蕊特生物科技有限公司提供,货号:S8056-00/01/05;miR-144基因由杭州开泰生物技术有限公司提供,货号:CD201-0011;Trizol试剂由武汉纯度生物科技有限公司提供,货号:CD-102523GM;磷酸盐缓冲液(PBS)由上海广锐生物科技有限公司提供,货号:PR694;磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)抗体由深圳豪地华拓生物科技有限公司提供,货号:PL0402037;蛋白激酶B(AKT)抗体由沈阳万类生物科技有限公司提供,货号:WL0003b。

1.2宫颈癌HeLa细胞培育和分组 先用双抗的RPMI1640、13%胎牛血清完全培养基,保存温度为38 ℃培养已购买的人宫颈癌HeLa细胞,每隔4 d替换新鲜培养液,当细胞融合度达到73%以上时,开始传代培养。选择人宫颈癌HeLa细胞,将其分为对照组、过表达组、沉默组。

1.3miR-135a-5p转染实验 对照组不做处理,过表达组转染miR-135a-5p mimics上调载体,沉默组转染miR-135a-5p inhibitor下调载体。miR-135a-5p mimics序列:上游引物5′-CAUUGCACUUGUCUCGGUCUGA-3′,下游5′-AGACCGAGACAAGUGCAAUGUU-3′;miR-135a-5p inhibitor序列:上游引物5′-UAUUGCACUCGUCCCGGCCUCC-3′,下游5′-AGGCCGGGACGAGUGCAAUAUU-3′,在转染过程中,每组培养基浓度均保持在120 nmol/L。

1.4荧光定量聚合酶链反应(PCR)实验 于11时取出培育好的宫颈癌HeLa细胞样本,实时RT-PCR法检验miR-135a-5p指标。选取转染72 h对照组、过表达组、沉默组miR-135a-5p细胞,并用Trizol试剂提取,将采集到的总核糖核酸经逆转录合成cDNA,配制反应体系可选用各组2 μl的核糖核酸样本,0.78 μl、1.23 μl、4.56 μl、0.27 μl的RT、dNTPs、5 ml缓冲液、逆转录酶(MMLV),保持15 ℃下,35 min。组建RT-PCR体系,其中包含1.33 μl、7.67 μl、1.2 μl、0.10 ml的无核酸酶水、cDNA、引物、探针混合物及通用混合物,小核RNA为内部。其中,miR-135a-5p序列:上游引物5′-GGGCGGAATTGCACTTGTC-3′,下游5′-CTCAACTGGTGGTGTCGT GGAGTC-3′,反应25 min,保持温度在75 ℃,接着50 ℃下反应10 min,循环40次,记录数值,即为miR-135a-5p表达量。

1.5四甲基偶氮唑盐(MTT)实验 宫颈癌HeLa细胞增殖能力检测使用MTT法:将每个组胰酶进行分解,形成单细胞悬液,离心5 min,丢弃上清液,使用5 ℃的洗液,洗涤2次。取配制的单细胞悬液,加0.23 ml、0.50 ml的MTT、70%乙醇,在-24 ℃下固定,并在5 ℃下放置12 h,离心9 min,洗液洗涤3次,放于无光环境下,取用碘化丙啶液染色,用SpectraMax Paradigm卡盒式多功能酶标仪(美谷分子仪器有限公司 上海)检测OD值,计算增殖能力指数。用Agilent NovoCyte 流式细胞仪(安捷伦科技公司 美国)检测宫颈癌HeLa细胞的凋亡能力。

1.6划痕实验 划痕实验用来检验宫颈癌HeLa细胞迁移能力,选宫颈癌HeLa细胞用胰蛋白酶分解,获取细胞悬液接种至6孔板上,并用0.014 ml移液器枪头将全部单层细胞从上至下画一条划痕,用PBS洗涤刮下细胞,向干净培养基中加4 ml溶液,37 ℃下培育29 h,弃去培养液,显微镜下观察并记录视野平均值,重复3次,取细胞迁移数平均值。

1.7Transwell小室实验 使用Transwell小室检验各组宫颈癌HeLa细胞侵袭能力指数,于15时将培养板置于Transwell小室,下室加120 ng/ml反应溶液、上室加细胞液,静放2 d,用三羟甲基丙烷溶液对培养板进行处理,PBS洗5次,每次洗5 min,固定并用苏木素染色,洗涤后,在显微镜下,观察上室的细胞数,记录视野内细胞数平均值,重复4次,取宫颈癌HeLa细胞侵袭数平均值。

1.8统计学处理 采用SPSS26.0软件进行F检验。

2 结 果

2.1miR-135a-5p转染效果验证 与对照组比较,过表达组miR-135a-5p指标明显升高,沉默组miR-135a-5p指标明显降低,有统计学差异(P<0.05);与过表达组比较,沉默组miR-135a-5p指标明显降低(P<0.05),说明miR-135a-5p转染成功。见表1。

表1 沉默miR-135a-5p对宫颈癌HeLa细胞增殖、迁移、侵袭、凋亡能力的影响个)

2.2沉默miR-135a-5p对宫颈癌HeLa细胞增殖、凋亡的影响 与对照组比较,过表达组(24、48、72 h)宫颈癌HeLa细胞增殖能力明显升高,凋亡能力明显降低,沉默组(24、48、72 h)宫颈癌HeLa细胞增殖能力明显降低、凋亡能力明显升高(P<0.05);与过表达组比较,沉默组(24、48、72 h)宫颈癌HeLa细胞增殖能力明显降低、凋亡能力明显升高(P<0.05)。见表1、图1。

图1 各组宫颈癌HeLa细胞增殖能力MMT实验(碘化丙啶染色,×200)

2.3沉默miR-135a-5p对宫颈癌HeLa细胞迁移的影响 与对照组比较,过表达组宫颈癌HeLa细胞迁移数明显较多,沉默组宫颈癌HeLa细胞迁移数明显较少(P<0.05);与过表达组比较,沉默组宫颈癌HeLa细胞迁移数明显较少(P<0.05);与对照组〔(75.21±8.11)%〕比较,过表达组宫颈癌HeLa细胞划痕愈合率〔(102.67±5.43)%〕明显较高,沉默组宫颈癌HeLa细胞划痕愈合率〔(62.31±5.48)%〕明显较低,与过表达组比较,沉默组宫颈癌HeLa细胞划痕愈合率明显较低(P<0.05)。见表1、图2。

图2 各组宫颈癌HeLa细胞迁移能力划痕实验(×100)

2.4沉默miR-135a-5p对宫颈癌HeLa细胞侵袭的影响 与对照组比较,过表达组宫颈癌HeLa细胞侵袭数明显较多、沉默组宫颈癌HeLa细胞侵袭数明显较少(P<0.05);与过表达组比较,沉默组宫颈癌HeLa细胞侵袭数明显较少(P<0.05)。见表1、图3。

3 讨 论

虽然预防宫颈癌的手段技术在不断提高,宫颈癌的诊治方案也在不断改善,可其对病患造成的病痛伤害是不可逆的〔6～9〕。宫颈癌特点是女性宫颈出现恶性肿瘤,其早期症状不明显,随着肿瘤增大从而引发并发症,进而影响宫颈癌病情。据某些研究报道〔10,11〕,宫颈癌通过血液循环扩散至患者机体其他脏器,进而加重病情,产生其他脏器并发症。据某些研究认为〔12〕,罹患宫颈癌与多种因素共同作用相关。

据某些研究报道〔13～15〕,miR-135a-5p在宫颈癌HeLa细胞中是一种多功能基因蛋白,在肿瘤治疗抵抗中具有重要警示作用,miR-135a-5p又包含多个子蛋白因子,其具有两个相对独立的功能域:N端的redox功能域、C端的DNA修复功能域。miR-135a-5p其内核心基因AP核酸内切酶活性是促进宫颈癌HeLa细胞增殖不可或缺的因子,且miR-135a-5p提供宫颈癌HeLa细胞内95%AP内切酶活性,亦就是表明miR-135a-5p造成宫颈癌HeLa细胞增殖,故其在宫颈癌机体中异常表达〔16～18〕。有研究认为〔19～21〕,miR-135a-5p基因可以和机体大约1/4微小RNA引起共鸣,其中miR-135a-5p在宫颈癌等病症中呈现高度异常,同时与宫颈癌HeLa细胞的出现有着密切联系。miR-135a-5p参与宫颈癌HeLa细胞增殖、侵袭过程,通过沉默miR-135a-5p亦可改变宫颈癌HeLa细胞迁移速度、侵袭效率,进而影响宫颈癌病灶组织病理反应。由此结果本研究推测,沉默miR-135a-5p可改变宫颈癌HeLa细胞基质的生物活性,此结果显示,当沉默miR-135a-5p表达量时,宫颈癌HeLa细胞的感染能力将会大幅度降低,缓解患者病情。

综上,miR-135a-5p与宫颈癌具有相关联系,检测miR-135a-5p表达对宫颈癌具有一定诊断效能,从而改变宫颈癌的治疗效率,miR-135a-5p为治疗宫颈癌提供借鉴指导,在宫颈癌治疗上值得探讨,miR-135a-5p对宫颈癌具有重要意义。