王花 姚元滨 何伍健

(青海省人民医院急诊内科,青海 西宁 810007)

动脉粥样硬化(AS)作为脑血管部位疾病,已成为威胁人类健康的危险疾病之一,颈动脉狭窄是AS的危险因素〔1〕,但目前其病理机制尚不完全明确,新的治疗方法和标志物都需进一步探究。自噬作为细胞内普遍存在现象,具有高度保守性,且自噬的发生受一系列自噬相关基因和信号通路的调控〔2,3〕。随着研究深入,发现在高脂饮食诱导的AS小鼠中可通过促进自噬改善AS,实现对疾病的缓解〔4〕。异甘草素(ISL)为甘草中的一类黄酮类化合物,在多种水果、蔬菜和药用植物中均广泛存在,已有研究表明,其具有感感染、抗脂质过氧化、抗肿瘤等多种功效〔5～7〕,在自噬中ISL能够激活自噬促进人表皮角质形成细胞中黑色素降解,从而抑制黑色素形成〔8〕,但尚未发现ISL在AS中的相关研究。本研究探讨ISL对AS斑块形成的影响,并探讨其机制。

1 材料与方法

1.1实验动物、试剂与仪器 动物:53只雄性SD大鼠〔北京维通利华实验动物技术有限公司,生产许可证号:SCXK(京)2016-0011〕,体质量(200±10)g。大鼠均在温度(24.0±0.5)℃、湿度(50±5)%、12 h黑暗12 h光照条件下自由饮水摄食。主要试剂与仪器:维生素D3(上海麦克林生化科技有限公司,货号:C804669-1g);ISL(南京春秋生物技术有限公司,CAS号:961-29-5,规格:HPLC 20%～98%);自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(MA,美国Sigma公司,货号:M9281,规格:100 mg);自噬激活剂西罗莫司(北京索莱宝科技有限公司,货号:IA0500);苏木素-伊红(HE)染色试剂盒(北京索莱宝科技有限公司,货号:G1120);一抗兔源微管相关蛋白1轻链3Ⅱ型(LC3Ⅱ)、自噬相关蛋白(Beclin1),二抗羊抗兔(英国abcam公司,货号分别为:ab192890、ab207612、ab205718)。颈动脉超声仪(深圳市德力凯医疗设备股份有限公司,型号:MVU-6300);透射电镜(美国FEI公司,型号:Talos);蛋白凝胶成像仪(北京中西远大科技有限公司,型号:JY02G)。本研究经医院伦理委员会审核并通过。

1.2分组及处理 43只大鼠参考文献〔9〕应用维生素D3联合高脂饮食法建立AS模型,高脂饲料:81.3%基础饲料、10%猪油、5%白糖、3%胆固醇、0.5%胆酸钠、0.2%丙基硫氧嘧啶。一次性腹腔注射600 000 U/kg维生素D3后每日喂高脂饲料20 g,连续45 d。随机取3只,主动脉组织光镜观察粥样斑块形成,则造模成功。剩余40只随机数字法分为模型组、ISL组、ISL+自噬抑制剂组、自噬激活剂组各10只。ISL组灌胃50 mg/kg ISL,ISL+自噬抑制剂组在ISL基础上腹腔注射100 mg/kg自噬抑制剂3-MA,自噬激活剂组腹腔注射1 mg/kg自噬激活剂西罗莫司。正常组喂基础饲料相同天数,连续4 w。

1.3超声仪检测各组动脉情况 颈动脉超声观察各组颈动脉内膜光滑度、增生、斑块情况,斑块大小和回声点。沿血管长轴测量管腔动脉后壁内膜-中层厚度(IMT);探头中点采样,控制血流和声速<60度,测量血流动力学参数指标斑块面积(S)。

1.4样本收集 股动脉采血,室温静置2 h,3 000 r/min离心20 min,上清备用,全自动生化分析仪检测血清中总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)含量;解剖大鼠,颈总动脉离体后,生理盐水反复冲洗,洗掉血细胞至颈总动脉半透明状,刀片小心切断硅胶管的固定丝线,取下硅胶管,剔除多余粘连组织,部分置于10%中性甲醛中固定,部分置于2.5%戊二醛中,部分置于-80 ℃冰箱保存。

1.5HE染色检测颈动脉病理情况 10%中性甲醛中取出组织,固定后依次经梯度酒精(75%酒精浸泡30 min→85%酒精浸泡30 min→95%酒精浸泡30 min→95%酒精浸泡30 min→100%酒精浸泡60 min→100%酒精浸泡60 min)脱水处理,脱水后二甲苯透明,放于石蜡中,切片机石蜡切片(厚度5 μm)。石蜡切片后染色,依次进入二甲苯中,梯度酒精(100%酒精浸泡5 min→100%酒精浸泡5 min→95%酒精浸泡5 min→85%酒精浸泡5 min→75%酒精浸泡5 min)脱蜡,切片浸泡入苏木素染液中,蒸馏水冲洗、1%盐酸乙醇分化、伊红染色,蒸馏水冲洗,梯度酒精(75%酒精浸泡2 min→85%酒精浸泡2 min→100%酒精浸泡5 min→100%酒精浸泡5 min)脱蜡,二甲苯中透明、中性树胶盖片,显微镜下观察血管壁、管腔情况。

1.6透射电镜观察颈动脉超微结构 2.5%戊二醛中取出组织,经磷酸缓冲液清洗后,放入2%四氧化锇中固定,取出血管,磷酸缓冲液清洗后梯度丙酮(70%～100%)脱水,丙酮:包埋剂2∶1浸泡血管,包埋剂处理后超薄切片机制成半薄切片(10 μm),甲苯胺蓝染色,光学显微镜观察并定位;超薄切片机切片(60 nm),碳酸铅染色,透射电镜观察超薄切片脂滴和自噬体情况。

1.7Western印迹检测颈动脉中LC3Ⅱ、Beclin1蛋白情况 -80 ℃冰箱中取20 mg颈总动脉,添加200 μl蛋白裂解液用眼科剪剪碎组织、研磨棒研磨充分,组织在冰上静置10 min,移液枪小心吸取上层清液,12 000 r/min、4 ℃离心20 min,吸上清液至新的1.5 ml EP管中,二喹啉甲酸(BCA)法检测蛋白浓度,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)胶凝胶电泳,聚偏氟乙烯(PVDF)300 mA转膜,5%脱脂奶粉室温封闭2 h;对应加入一抗LC3Ⅱ、Beclin1、GAPDH;对应加入二抗,室温孵育2 h。发光液避光显色,蛋白凝胶成像仪曝光拍照和定量分析。

1.8统计学分析 采用GraphPad Prism7.0软件进行单因素方差分析、SNK-q法。

2 结 果

2.1ISL对颈动脉IMT、斑块S的影响 与正常组相比,模型组、ISL组、ISL+自噬抑制剂组、自噬激活剂组颈动脉IMT、斑块S水平明显升高(P<0.05);与模型组相比,ISL组、自噬激活剂组颈动脉IMT、斑块S水平、ISL+自噬抑制剂组斑块S水平明显降低(P<0.05);与ISL组相比,ISL+自噬抑制剂组颈动脉IMT、斑块S水平明显升高(P<0.05);与ISL+自噬抑制剂相比,自噬激活剂组颈动脉IMT、斑块S水平明显降低(P<0.05)。见表1。

表1 各组颈动脉IMT、斑块S水平、血清中TC、TG、LDL-C含量、颈动脉中LC3Ⅱ、Beclin1蛋白表达比较

2.2ISL对血清中TC、TG、LDL-C含量的影响 与正常组相比,模型组、ISL+自噬抑制剂组血清中TC、TG、LDL-C含量明显升高(P<0.05);与模型组相比,ISL组、自噬激活剂组血清中TC、TG、LDL-C含量、ISL+自噬抑制剂组血清中LDL-C含量明显降低(P<0.05);与ISL组相比,ISL+自噬抑制剂组血清中TC、TG、LDL-C含量明显升高(P<0.05);与ISL+自噬抑制剂组相比,自噬激活剂组血清中TC、TG、LDL-C含量明显降低(P<0.05)。见表1。

2.3ISL对颈动脉病理情况的影响 正常组动脉结构完整,胞核形状规则,内膜、外膜及外膜界限清晰;模型组出现动脉管壁明显增厚现象,管腔中可见明显的粥样或纤维斑块、内膜中可见白色条纹或黄白色斑块;ISL组和自噬激活剂组动脉壁弹性明显恢复,管腔内脂斑沉淀明显减少,较模型组有明显减少;ISL+自噬抑制剂组与模型组类似,出现明显的粥样或纤维斑块。见图1。

图1 各组颈动脉病理学观察(HE染色,×100)

2.4ISL对颈动脉自噬体情况的影响 正常组无粥样硬化斑块,无自噬体空泡聚集、可见少量脂滴;模型组较正常组斑块中自噬体、脂滴有所增多;ISI组和自噬激活剂组斑块内可见明显的自噬体,可见大量自噬溶酶体;ISL+自噬抑制剂组中自噬小体数量减少、出现大量脂滴。见图2。

图2 各组颈动脉自噬体情况(碳酸铅染色,×5 000)

2.5ISL对颈动脉中LC3Ⅱ、Beclin1蛋白表达的影响 与正常组相比,ISL组、ISL+自噬抑制剂组、自噬激活剂组颈动脉中LC3Ⅱ、Beclin1蛋白水平、模型组颈动脉中LC3Ⅱ蛋白水平明显升高(P<0.05);与模型组相比,ISL组、自噬激活剂组颈动脉中LC3Ⅱ、Beclin1蛋白水平明显升高(P<0.05);与ISL组相比,ISL+自噬抑制剂组颈动脉中LC3Ⅱ、Beclin1蛋白水平明显降低(P<0.05);与ISL+自噬抑制剂组相比,自噬激活剂组颈动脉中LC3Ⅱ、Beclin1蛋白水平明显升高(P<0.05)。见表1、图3。

1～5:正常组、模型组、ISL组、ISL+自噬抑制剂组、自噬激活剂组图3 各组颈动脉中LC3Ⅱ、Beclin1蛋白表达

3 讨 论

AS属慢性炎症性疾病,由AS引起的脑卒中和冠心病已成为影响人类健康的主要原因,AS中斑块形成、破裂与炎症反应、血管内皮因子失衡、细胞自噬等关系密切,但目前自噬在AS中认识尚不够全面,一般认为适度自噬对AS具有保护作用〔10,11〕。本研究结果提示,AS出现脂质代谢异常现象,脂滴积累在病变部位形成富含脂质的坏死中心,随着病变加深,斑块形成,导致动脉管壁变厚,易造成血栓,严重时危害生命。ISL有着多靶点、途径好、效应广等优点,能够调控多种途径影响疾病进程,在糖尿病视网膜病变中,ISL能下调miR-195表达从而减轻链脲佐菌素诱导的视网膜损伤中的氧化应激和炎症〔12〕;在抗癌作用中通过抑制活性氧激活的c-Jun氨基末端激酶(JNK)通路和细胞色素c从线粒体中释放至结直肠癌细胞中,从而发挥抗癌作用〔13〕;ISL能够抑制磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B/哺乳动物雷帕博霉素蛋白信号通路进而抑制786-0细胞的增殖、迁移、侵袭并诱导细胞自噬发生,从而成为一种有效的肾透明细胞癌抑制剂〔14〕。ISL可调控氧化应激、炎症、活性氧、细胞增殖、侵袭、迁移、自噬等过程,发挥作用。经ISL治疗后,颈动脉IMT降低、管腔和内膜中斑块消失,动脉管壁变薄,血清中TC、TG、LDL-C含量降低,ISL能够减少AS中脂滴、斑块形成,从而缓解AS,但ISL效应广,具体影响机制途径尚需进一步研究。

自噬现象在细胞内普遍存在,可通过降解细胞内损伤细胞器、错误折叠蛋白及侵入细胞内细菌、病毒等,从而维持细胞正常功能,是一种自我保护、调控机制。自噬与AS关系密切,为保护巨噬细胞免受氧化损伤,通过自噬过程降解过量的蛋白和受损细胞器〔15,16〕,自噬参与胆固醇转运和脂肪进入溶酶体过程、参与脂滴的分解过程,自噬介导的细胞胆固醇外流在维持胆固醇平衡中发挥重要作用,进而阻止AS的发生发展〔17〕。LC3Ⅱ能够结合在脂滴表面,在原位形成受限膜,使脂滴的一部分被分离,并在Beclin1等因子协助下形成自噬体〔18〕。本研究结果提示,在颈动脉斑块中自噬加强,可促进脂滴分解等过程,从而维持细胞正常功能。添加ISL后与添加自噬激活剂作用类似,均可促进自噬进一步加强,降低脂滴数量;在ISL基础上添加自噬抑制剂,自噬减弱,出现大量脂滴,斑块明显;提示ISL能够加强自噬作用实现对斑块形成的缓解。

综上,ISL能够激活自噬并缓解ISL斑块形成,进而实现对ISL疾病的保护。但自噬途径较多,可能受单一途径或多途径影响,探究ISL具体影响途径将是下一步探究重点。