杨丽娜 王恩峰 许卓茂 符景旦 孙轶群

(海南西部中心医院整复烧伤科,海南 儋州 571700)

糖尿病的患病率和发病率急剧攀升,已成为全球重要公共保健问题之一,糖尿病正严重威胁人们的生命健康,预计到2045年糖尿病患者人数将达6.29亿,国际糖尿病联合会最新发布《糖尿病地图》显示,我国有1.14亿糖尿病患者,居世界首位〔1,2〕。糖尿病患者由于长期的血糖、血脂代谢异常,抗氧化能力下降,合并神经病变及各种不同程度下肢血管病变及局部组织缺血,是导致溃疡形成的重要原因,临床主要表现为溃疡、感染和坏疽。糖尿病足是截肢的首位原因,糖尿病足患者有 14%～24%需要截肢,约 85%截肢由足溃疡引发,国外相关报道每年因糖尿病足所引起的截肢在(5.7～20.5)人/10 万人,是糖尿病患者致残、致死的主要原因〔3,4〕。糖尿病足溃疡和截肢所带来的医疗消耗巨大,几乎相当于糖尿病其他并发症的总和,所以糖尿病慢性溃疡治疗非常重要。本研究通过动物实验探讨脂肪来源间充质干细胞(ADSCs)联合纳米银凝胶敷料对大鼠糖尿病慢性创面愈合的影响。

1 资料与方法

1.1实验仪器 台式低速离心机(长沙英泰仪器有限公司);倒置显微镜〔奥林巴斯(北京)销售服务有限公司〕;生化培养箱(上海精宏实验设备有限公司);CO2培养箱(SANYO);电子天平(昆山优科维特电子科技有限公司);血糖仪(三诺生物传感股份有限公司);小动物麻醉机(英国Mss);数码相机(苏州富士胶片映像机器有限公司);全波长酶标分析仪(北京普天新桥);恒温摇床(BLabotery);脱水机(DIAPATH);包埋机(武汉俊杰电子有限公司);病理切片机(上海徕卡仪器有限公司);冻台(武汉俊杰电子有限公司);组织摊片机(浙江省金华市科迪仪器设备有限公司),烤箱(天津市莱玻瑞仪器设备有限公司);载玻片(Servicebio);正置光学显微镜(日本尼康);成像系统(日本尼康)。

1.2实验材料 Ⅰ型胶原酶购自Biosharp,DMEM/F12(1∶1)、胎牛血清、GlutaMAX(TM)-I(100X)、0.25%胰酶均购自Gibco,柠檬酸、无水乙醇、二甲苯均购自国药集团化学试剂有限公司,柠檬酸三钠购自阿拉丁,链脲佐菌素(STZ)购自麦克林,血糖试纸购自三诺生物传感股份有限公司,0.9%氯化钠注射液购自四川科伦药业股份有限公司,异氟烷购自上海雅衍信息科技有限公司,Rat转化生长因子(TGF)-β酶联免疫吸附试验(ELISA)KIT、Rat血管内皮生长因子(VEGF)ELISA KIT、Rat白细胞介素(IL)-6 ELISA KIT、Rat肿瘤坏死因子(TNF)-α ELISA KIT均购自上海酶联生物科技有限公司,环保型脱蜡透明液购自Servicebio,苏木素-伊红(HE)染色试剂盒购自Solarbio。

1.3实验动物 清洁级2月龄SD雄性大鼠200只,100只用于建模分组,另100只用于提取脂肪制备脂肪干细胞,雄性,体质量200～250 g,饲养环境湿度50%～60%,温度22～24 ℃,光照/暗循环12 h/12 h,可随意获取食物和水。

1.4糖尿病慢性创面大鼠模型建立 实验用大鼠在实验前12 h禁食,定量饮水。将1% STZ溶液,以60 mg/kg剂量腹腔内注射2 d。间隔48 h,连续两次测量,诱导大鼠糖尿病,2 d后动物血糖水平>250 mg/dl、尿糖为(++++)时,表明动物患有糖尿病,即成糖尿病大鼠模型。将糖尿病大鼠用盐酸氯胺酮(100 mg/kg)腹腔注射麻醉后背部备皮,在脊柱两侧分别作直径2 cm的圆形标记,面积大约3.14 cm2。在无菌条件下,用外科方法切除标记处全层皮肤,止血后用无菌纱布覆盖,在背部形成2 cm直径的全层皮肤缺损,用生物胶固定伤口,防止伤口自行愈合,用纳米银水胶体敷料覆盖创面,继续养殖30 d,使其成为糖尿病慢性创面大鼠模型,手术后注射 4 000 U青霉素钠防止感染。

1.5动物实验分组 将糖尿病慢性创面模型大鼠随机分为9个实验组和1个对照组各10只,将ADSCs按照1×106、5×106、1×107个细胞数与脂肪胶(SVF-gel)混合后外用于慢性创面;同时将ADSCs细胞按照 5×106个细胞的量注射在创面周边皮下。将 ADSCs的不同剂量及处理方式分成9个治疗组:A组(创面皮下注射5×106ADSCs),B组(创面涂抹SVF-gel),C组(创面涂抹SVF-gel+1×106ADSCs),D组(创面涂抹SVF-gel+5×106ADSCs),E组(创面涂抹SVF-gel+1×107ADSCs),F组(创面皮下注射5×106ADSCs+创面涂抹SVF-gel),G组(创面皮下注射5×106ADSCs+创面涂抹SVF-gel+创面涂抹1×106ADSCs),H组(创面皮下注射5×106ADSCs+创面涂抹SVF-gel+创面涂抹5×106ADSCs),I组(创面皮下注射5×106ADSCs+创面涂抹SVF-gel+创面涂抹1×107ADSCs),另设1个对照组J组(纳米银凝胶敷料换药)。治疗后,1、2、3 w观察各组创面面积、愈合率、愈合速率、血清细胞因子及组织病理分析。 纳入标准:(1)大鼠饲养环境相同;(2)符合糖尿病慢性溃疡;(3)对大鼠处置符合医学伦理要求。

1.6脂肪源性干细胞分离、培养 (1)SVF-gel制备:麻醉消毒后,切取100只大鼠腹股沟区脂肪层获取脂肪,将获取的脂肪组织剔除纤维结缔组织,弃掉液体部分备用。将脂肪组织分装到20 ml注射器中,严格无菌操作,置入离心机中,离心机1 200 r/min离心10 min。提取中间层高密度脂肪组织,将装有高密度脂肪的无菌注射器与另一只全新的20 ml无菌注射器用内径为2.4 mm柔软鲁尔连接头密闭连接,两个互相连接的20 ml注射器形成相对密闭空间,推动注射器活塞(推注速度10 ml/s),将脂肪组织通过切割连接头在两个注射器中往返推注20次。使其变成乳糜状脂肪(Nanofat),剔除结缔组织后入离心机中,设置参数为1 600 r/min,离心3 min。用1 600 r/min离心力离心3 min,去除上层油脂及底层红细胞等得到中间层即为我们实验所需的 SVF-gel,其中含有高度浓缩的ADSCs,整个实验过程坚持无菌原则。 (2)ADSCs单细胞悬液制备:取制备的脂肪组织,加入体积相等的0.075%Ⅰ型胶原酶,将标本置入37 ℃气浴振荡器中,予以消化约30 min。消化后的组织400 r/min离心5 min,弃掉上层未完全消化的组织及上清液。 然后磷酸盐缓冲液(PBS)分次清洗多余的Ⅰ型胶原酶,再次400 r/min离心5 min,弃掉上清液,收集底层细胞群,PBS 重悬。悬液通过100、70、40 μm的细胞筛网过滤,去除未完全消化的纤维结缔组织,形成富含 ADSCs 单细胞悬液。(3)脂肪来源干细胞ADSCs体外扩增培养:将新鲜分离的细胞群,按照1×104～2×104个细胞数接种在10%胎牛血清、100 U/ml青链霉素的DMEM完全培养基中,置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养。根据细胞在培养皿中的密度及培养基的颜色,隔天更换培养基。当细胞爬满(95%左右)培养皿底部,胰酶消化后继续分皿培养,直至细胞达到1×108个,然后无菌分管-80 ℃冻存,备用。

1.7脂肪源性间充质干细胞与纳米银凝胶敷料生物相容性评估 将纳米银凝胶混入培养基,然后添加脂肪源性间充质干细胞进行培养。通过显微镜观察脂肪源性间充质干细胞贴壁生长的状态及生长速度,并用流式细胞仪检测脂肪源性间充质干细胞的分化状态。

1.8脂肪源性间充质干细胞疗效及安全性评估 (1)处置前清除胶水,拍照记录创面情况,用带有网格的塑料板,每一个方格面积为1 mm2,用网格板测量创面大小精确计算面积。 (2)创面进行彻底清创,用生理盐水反复清洗创面,将ADSCs悬浮液转入1 ml注射器中,各实验组采用不同剂量脂肪间充质干细胞,均匀涂抹于创面及注射于创面边缘皮下。 (3)应用干细胞后的创面外用纳米银凝胶敷料包扎。连续观察各组1、2、3 w伤口愈合情况,观察、记录创面愈合面积和时间并计算愈合率及愈合速率。 (4)创面完全愈合后,处死大鼠,取大鼠创面愈后病理标本用10%甲醛溶液固定,常规石蜡包埋,做HE染色并于光学显微镜或电子显微镜下观察新生组织的形态、表皮细胞、成纤维细胞、血管密度、炎性细胞、胶原沉积等指标。 (5)各组预留2只大鼠长期饲养,直至自然死亡或时间大于2年,做细胞治疗安全性评估。

1.9比较不同浓度脂肪源性间充质干细胞或以不同种植方式对糖尿病慢性创面愈合的影响 研究不同处理方式下创面的愈合速度、愈合质量及愈合组织显微镜下的形态学及结构变化。找出最佳愈合给药浓度或者相同愈合效果最低给药浓度。

1.10统计学方法 采用SPSS25.0软件进行单因素方差分析、秩和检验。

2 结 果

2.1一般情况比较 注射STZ溶液后,给药前,各组大鼠毛色光滑,体态、饮食、活动均正常,各组大鼠体重及血糖差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 各组体质量、创面面积、愈合率、愈合速率

2.2各组残余创面面积 治疗后第7、14天,各组间残余创面面积差异存在统计学意义(P<0.05),而21 d时差异无统计学意义(P>0.05)。在第7天和第14天,H组残余创面面积明显小于其他实验组及对照组(P<0.05),愈合最佳给药浓度为:创面皮下注射5×106ADSCs+创面涂抹SVF-gel+创面涂抹5×106ADSCs。见表1。

2.3各组创面愈合率 各组创面愈合率在7 d时差异有统计学意义(P<0.05),14 d与21 d组间差异无统计学意义(P>0.05)。第7天,H组创面愈合率明显大于其他实验组及对照组(P<0.05),愈合最佳给药浓度为创面皮下注射5×106ADSCs+创面涂抹SVF-gel+创面涂抹5×106ADSCs。见表1、图1。

图1 H组创面随时间迁移愈合情况

2.4各组创面愈合速率 各组创面愈合速率在7、14 d时差异有统计学意义(P<0.05),而第21天组间差异无统计学意义(P>0.05)。在第7、14天,H组创面愈合速率明显高于其他实验组及对照组(P<0.05)。见表1。

2.5各组创面组织病理学对比 治疗后第7、14天,对照组较多炎症细胞浸润,同时有少量毛细血管及纤维细胞生长;实验组有较少炎症细胞浸润,有较多毛细血管及纤维细胞生长。H组与其他实验组相比,炎症细胞浸润较少,毛细血管及纤维细胞生长较多。见图2。

图2 各组组织病理观察(HE染色,×400)

3 讨 论

糖尿病创面难以愈合的原因与晚期糖基化终产物(AGEs)增加、长期慢性炎症反应、周围神经功能障碍等密切相关〔5〕。缺血、神经病变和感染是导致组织坏死和溃疡形成的 3 个主要因素,局部的高血糖代谢产生的糖脂代谢产物异常的增高,引起血管基底膜的改变,进而形成微血管病〔6〕。血管病变是糖尿病足溃疡发生的一个机制,改善局部的血供是治疗糖尿病溃疡的策略之一〔7〕。新生血管的形成是一个复杂的过程,不仅需要内皮细胞增殖,还需要多种生长因子的作用。糖尿病患者体内环境异常会影响ADSCs的生物学功能,影响创面愈合〔8〕。再上皮化延迟、炎症细胞浸润及肉芽组织形成减少、血管再生能力降低、胶原分泌减少及胶原化紊乱,涉及血管病变、神经病变、感染及局部微环境异常等,创面局部微环境异常包括局部高血糖环境、 氧化应激、生长因子及细胞因子表达异常等〔5,9,10〕。因其发病机制复杂、病程较长,治疗难度较大,严重影响患者的生活质量,成为目前医学研究的热点、重点及难点。糖尿病创面作为慢性难愈合创面的典型,主要特点为:创面大多比较深,合并感染多见;动脉硬化多见、管壁增厚明显,肉芽组织脆弱生机低下;瘢痕组织增生,有时骨化发生;反复发作,迁延不愈〔11〕。最常用的方法是严格控制血糖基础上,彻底清创、负压吸引、换药等治疗,创伤大、时间长。患者迫切希望有更加快速安全有效无痛的治疗方法,解决糖尿病足慢性溃疡创面问题,降低截肢概率,提高生活质量。研究发现,来源于脂肪组织中的活性成分-脂肪基质血管成分(SVF),包含 ADSCs、内皮组织细胞、血细胞、T 细胞、抗炎细胞等,能够分泌多种细胞因子,具有较强的自我更新能力,可分化为各种类型的功能细胞,具有向内皮细胞表型分化并且有在体内参与血管形成的潜能,可以改善局部血液循环,形成有利于组织细胞存活和功能维持的微环境,被认为是组织再生和修复的最理想细胞来源〔12～14〕。ADSCs 在皮肤创伤愈合的干细胞治疗中有巨大潜力,与骨髓来源的干细胞相比,ADSCs 具有更强的造血和修复组织能力,其体积小,分化程度低,对创伤和缺氧的耐受力比成熟脂肪细胞好。脂肪来源的干细胞自体移植免疫原性低、不涉及伦理问题,被认为是骨髓间充质干细胞的理想替代物〔15〕。对糖尿病足缺血组织具有重要的应用价值〔16〕。大量研究显示,ADSCs 在糖尿病溃疡治疗方面具有极大潜力,可通过增加上皮化和肉芽组织形成、抗炎和抗凋亡作用及释放VEGF及成纤维细胞因子(FGF),通过旁分泌机制激活成纤维细胞和角质形成细胞,从而促进难愈性创面愈合〔17～20〕。其机制可能与代偿升高有关,ADSCs 是安全的,能在体外扩增,具有分化为多种细胞谱系的能力。ADSCs 治疗糖尿病溃疡患者可增强溃疡演化,减少疼痛,降低疼痛评分,改善跛行及行走距离,可以促进慢性溃疡的愈合,需要更多的研究来确定 ADSCs 在治疗糖尿病慢性溃疡中的确切作用,ADSCs 在糖尿病慢性创面细胞再生治疗中具有广阔的应用前景。在糖尿病足慢性创面的修复上国内外学者采用了多种技术,取得了较好的效果,有专家用脂肪干细胞注射治疗大鼠慢性创面,或外用都得到了肯定的疗效。但也存在患鼠感染死亡率高,模型不稳定的情况。虽然有明确的数据证实了 ADSCs 对慢性创面的作用,但对使用的量和效果之间的关系没有进一步阐述。纳米银凝胶敷料含有一定浓度的银离子,具有抑菌作用,兼具保湿作用,有利于抑制局部感染改善 ADSCs 的存活环境〔21〕。本研究结果提示,经ADSCs联合纳米银凝胶敷料干预的实验组病理结果可见更少的炎症细胞浸润及更多的纤维细胞和毛细血管生长。其中以H组皮下注射与外用涂抹给药联合外涂SVF-gel效果最佳,并得出了最佳给药浓度。

综上,利用纳米银凝胶敷料保湿、抗菌的作用,并用SVF-gel混合改善慢性创面局部 ADSCs 生长环境,促进 ADSCs 存活,可提高 ADSCs 对慢性创面的治疗效果。