任美颖 金燕 樊思轩 舒丽莎

(河北北方学院 1第一临床医学院,河北 张家口 075000;2附属第一医院妇科)

目前宫颈癌的被关注度越来越高,已成为全球女性恶性肿瘤第4位。根据癌症报告指示,在2020年全球新发宫颈癌病例超过60万,其中死亡病例超过30万,严重威胁女性健康〔1〕。近年来,随着人乳头瘤病毒(HPV)疫苗的预防性接种、HPV感染筛查的逐渐普及、宫颈癌早期诊治方面的极大改善,尽管在发达地区其发病率和病死率有所下降,但是在经济落后地区仍呈上升趋势〔2〕。高危型HPV持续感染是宫颈病变发生的主要病因,此外,癌基因的激活或抑癌基因的缺失对宫颈病变发展成癌的过程亦起关键作用〔3〕。因此,阐明宫颈癌发生发展的分子机制,研发宫颈癌靶向治疗的新型标记分子至关重要。

长链非编码RNA是非编码RNA的子集,在转录和转录后水平均发挥作用,调控肿瘤细胞的分子生物学功能,获得增殖、转移及侵袭的能力。UC001kfo是一种长链非编码RNA,可通过调控细胞增殖、分化等多种途径参与肝癌、乳腺癌、肺癌等恶性肿瘤的进展〔4,5〕。目前关于UC001kfo在宫颈癌中的作用机制仍不明确,为此本实验检测UC001kfo在宫颈癌细胞系HeLa中的表达水平,研究UC001kfo对宫颈癌HeLa细胞生物学行为的影响,为宫颈癌分子靶向治疗提供方向。

1 材料与方法

1.1细胞株 人宫颈上皮永生化细胞株H8购于中国协和医科大学;人宫颈癌细胞株HeLa由河北北方学院生命科学研究中心细胞实验室赠予。

1.2主要试剂 RPMI1640培养基、杜尔伯科改良伊格尔培养基(DMEM)、青链霉素合剂、0.25%胰蛋白酶乙二胺四乙酸(EDTA)购于美国Gibco公司;胎牛血清(FBS)购于上海ExCellBio公司;LipofectamineTM3000购于美国ThermoFisher公司;质粒、siRNA由苏州吉玛公司构建;引物均由生工生物工程公司合成;Trnzol、聚合酶链反应(PCR)试剂盒均购自北京天根生化公司;CCK-8试剂购自日本同仁公司;Transwell小室购自美国康宁公司;α-平滑肌肌动蛋白(SMA)抗体、波形蛋白(Vimentin)抗体、E-钙黏蛋白(cadherin)抗体均购自北京博奥森公司。

1.3细胞培养 用RPMI1640完全培养基培养H8细胞,DMEM完全培养基培养HeLa细胞,在37 ℃、5%CO2饱和温度条件下常规培养,待细胞生长状态良好且融合至85%左右,用胰蛋白酶消化细胞,传代后进行后续实验。

1.4RT-PCR检测UC001kfo在H8和HeLa细胞中表达水平 所有操作佩戴手套、口罩和帽子,在消毒灭菌后的超净台内进行,使用RNase-free的枪头和EP管以防RNA快速降解。提前选取生长状态良好的2种细胞种板,置于37 ℃恒温培养箱孵育,待细胞密度达85%左右,TRNzol裂解细胞后提取总RNA,用超微量分光光度计检测RNA浓度、纯度。参照PCR试剂说明书将RNA反转录为cDNA,再以cDNA为模板,在95 ℃预变性3 min×1,95 ℃变性5 s,60 ℃退火/延伸31 s×40的条件下行PCR扩增,引物序列:UC001kfo正向引物:5′-GCCAACGCAAGAAGTTACCA-3′,反向:5′-CCAAATCATTCCTAGCCAAAG-3′;α-SMA正向引物:5′-CTGTCCACCTTCCAGCAGATGT-3′,反向:5′-GATTCGTCGTCCTGAGAAGTCG-3′;磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)正向引物:5′-TCGGAGTCAACGGATTTGGT-3′,反向:5′-TTCCCGTTCTCAGCCTTGAC-3′。采用 2-ΔΔCt方法分析相对表达量。

1.5细胞转染 选取对数生长期的HeLa细胞,参照LipofectamineTM3000说明书分别将siUC001kfo.1、siUC001kfo.2、siUC001kfo.3、siRNA-NC、pCDNA3.1(+)-Vector及3种不同剂量LipofectamineTM3000的质粒转染至HeLa细胞中,构建空白对照组、pCDNA3.1(+)-UC001kfo、pCDNA3.1(+)-Vector、siRNA-UC001kfo和siRNA-NC组。TRNzol裂解细胞并提取总RNA,RT-PCR分析UC001kfo的转染效率,择上调效果及干扰效果最佳转染效率进行后续实验。

1.6CCK-8检测HeLa细胞增殖力 选取生长状态良好的5组HeLa细胞转染48 h后,用胰蛋白酶消化细胞,计数并接种于96孔板,各组均设5个复孔,待细胞融合至80%左右,分别待细胞培养至12、24、36、48、72 h后于每孔各加10 μl CCK-8溶液,混匀后再孵育2 h,用Fisherbrand测各孔细胞450 nm处光密度(OD)值。

1.7划痕实验检测HeLa细胞迁移率 选取对数生长期的5组HeLa细胞转染48 h后,用胰蛋白酶消化细胞,计数后接种于6孔板中,待细胞融合至95%左右,用10 μl枪头在每孔各划3条竖线,线段贯穿培养板整个孔,尽量保持各孔线段宽度一致。用磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗悬浮细胞和细胞碎片,每孔各加2 ml完全培养基,在倒置显微镜下拍照记录并将其作为0 h细胞迁移状况图予以保存。分别孵育至24、48、72 h后测量划痕宽度并记录。

1.8Transwell检测HeLa细胞侵袭 将Matrigel胶置于4 ℃冰箱中液化,用DMEM维持液按1∶3稀释,每孔各加60 μl Matrigel胶稀释液迅速铺至预冷的Transwell小室内,覆盖聚碳酯膜,于37 ℃孵育1 h,使Matrigel胶凝固。5组细胞用DMEM维持液饥饿12 h后,胰酶消化并离心,细胞计数为(1～5)×107个/L,每孔200 μl细胞悬液接种于Transwell上室;Transwell下室吸800 μl完全培养基。37 ℃恒温培养24 h后,吸弃小室内培养基,用棉签轻轻擦拭Matrigel胶,4%多聚甲醛固定20 min,0.1%结晶紫染色液染色15 min。基于Transwell上下室的营养成分不同,通过趋化作用,待风干后,在倒置显微镜下观察细胞侵袭能力后拍照记录。

1.9RT-PCR检测UC001kfo与α-SMA的表达相关性 提前将对数生长期的5组HeLa细胞接种于6孔板,于37 ℃培养箱中孵育,待细胞融合至50%进行转染,48 h后提总RNA,检测RNA浓度和纯度。PCR步骤同前,引物序列见1.4,采用 2-ΔΔCt方法分析α-SMA相对表达量。

1.10Weatern印迹分析蛋白表达 收集生长状态良好的6组〔pCDNA3.1(+)-UC001kfo、pCDNA3.1(+)-Vector、siRNA-UC001kfo、siRNA-NC、pCDNA3.1(+)-UC001kfo.3+siα-SMA及空白对照组〕HeLa细胞,并提取蛋白。以GAPDH为内参,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)后转膜;5%脱脂奶粉室温封闭2 h;一抗4 ℃孵育过夜;二抗室温孵育2 h;二氨基联苯胺(DAB)显色液显色,AI600上机检测条带并保存图像,ImageJ分析并计算灰度值。

1.11统计学方法 采用SPSS26.0软件分析数据;GraphPad Prism5软件绘图。组间比较采用单因素方差分析和重复测量方差分析,组间多重比较用LSD-t检验。

2 结 果

2.1UC001kfo在宫颈癌HeLa细胞中显著高表达 RT-PCR结果显示,与H8细胞(1.001 7±0.072)相比,HeLa细胞中LncRNA UC001kfo表达水平(2.2219±0.153)显著升高(t=12.466,P<0.01)。

2.2确定转染效率 与siRNA-NC组(0.998±0.499)和空白对照组LncRNA UC001kfo表达水平(0.995±0.035)相比,siUC001kfo.1组(0.009±0.000 6)、siUC001kfo.2组(0.005±0.000 3)、siUC001kfo.3组中UC001kfo表达水平(0.007±0.000 3)明显降低,以siUC001kfo.2组降低更显著(F=1 187.404,P<0.05)。因此后续实验选取siUC001kfo.2转染至HeLa细胞沉默UC001kfo表达。与pCDNA3.1(+)-Vector组(1.036±0.132)和空白对照组(1.018±0.033)LncRNA UC001kfo表达水平相比,pCDNA3.1(+)-UC001kfo.1组(8.366±0.062)、pCDNA3.1(+)-UC001kfo.2组(11.051±0.083)、pCDNA3.1(+)-UC001kfo.3组中UC001kfo表达水平(24.091±0.262)明显升高,以pCDNA3.1(+)-UC001kfo.3组升高最显著(F=13 972.672,P<0.05)。因此后续实验选取pCDNA3.1(+)-UC001kfo.3转染至HeLa细胞来上调UC001kfo的表达。

2.3上调UC001kfo表达增强宫颈癌HeLa细胞增殖能力 CCK-8实验结果显示,不同时间pCDNA3.1(+)-Vector组、空白对照组和siRNA-NC组增殖活力大致相同;与pCDNA3.1(+)-Vector组相比,pCDNA3.1(+)-UC001kfo.3组OD值在各时间段均显著增高(P<0.05),说明上调UC001kfo的表达可促进Hela细胞增殖力,且在72 h促进效果更显著;相反,siRNA-UC001kfo.2组在各时间段的OD值均显著低于siRNA-NC组(P<0.05),说明沉默UC001kfo的表达抑制其增殖力,且在72 h抑制效果较佳。见表1。

表1 不同时间UC001kfo对HeLa细胞增殖活力的影响

2.4上调UC001kfo表达增强宫颈癌Hela细胞迁移能力 划痕实验结果显示,上调UC001kfo表达促进了Hela细胞的迁移能力;相反,沉默UC001kfo表达对Hela细胞的迁移能力具有抑制作用。与pCDNA3.1(+)-Vector组和空白对照组相比,pCDNA3.1(+)-UC001kfo.3组在细胞孵育24、48和96 h时划痕面积愈合百分比明显增高,且96 h较48 h促进效果更明显(P<0.05);相反,与siRNA-NC组和空白对照组相比,siRNA-UC001kfo.2组细胞划痕宽度显著减小,且96 h较48 h抑制效果更显著(P<0.05)。见表2、图1。

表2 各组划痕24、48和96 h迁移率及EMT相关蛋白表达比较

2.5上调UC001kfo表达增强宫颈癌Hela细胞侵袭能力 Transwell实验结果显示,上调UC001kfo表达促进了宫颈癌Hela细胞的侵袭;相反,沉默UC001kfo表达抑制了宫颈癌Hela细胞侵袭。与空白对照组单位面积侵袭细胞数目〔(341.333±27.301)个/视野〕相比,pCDNA3.1(+)-Vector组〔(477.333±52.814)个/视野〕和siRNA-NC组〔(337.000±30.806)个/视野〕从上室穿过多孔膜至下室的细胞数无显著改变(P>0.05);与pCDNA3.1(+)-Vector组相比,pCDNA3.1(+)-UC001kfo.3组〔(1 814.333±143.040)个/视野〕单位面积侵袭细胞数目明显增多;相反,与siRNA-NC组相比,siUC001kfo.2组〔(189.000±11.000)个/视野〕单位面积侵袭细胞数目显著降低(F=267.743,P<0.05)。见图2。

2.6UC001kfo与α-SMA mRNA在HeLa细胞中呈正相关 RT-PCR结果显示,pCDNA3.1(+)-Vector组(1.089±0.167)、空白对照组(1.008±0.150)和siRNA-NC组中α-SMA mRNA(1.002±0.164)无显著差异(P>0.05)。与pCDNA3.1(+)-Vector组和空白对照组相比,pCDNA3.1(+)-UC001kfo.3组α-SMA mRNA表达(2.682±0.020)显著升高;与siRNA-NC组和空白对照组相比,siUC001kfo.2组α-SMA mRNA表达(0.304±0.052)显著降低(F=143.533,P<0.05)。

2.7UC001kfo影响HeLa细胞EMT Western印迹显示,与空白对照组及pCDNA3.1(+)-Vector组比较,pCDNA3.1(+)-UC001kfo.3组Vimentin和α-SMA蛋白表达显著升高, E-cadherin蛋白表达显著降低(P<0.05)。与空白对照组及siRNA-NC组比较, siUC001kfo.2组Vimentin和α-SMA蛋白表达显著降低,E-cadherin蛋白表达显著升高(P<0.05)。pCDNA3.1(+)-Vector组、siRNA-NC组和空白对照组Vimentin、α-SMA和E-cadherin蛋白表达无显著性差异(P>0.05)。说明UC001kfo对宫颈癌HeLa细胞EMT过程具有促进作用。见表2、图3。

1～5:pCDNA3.1(+)-UC001kfo.3组、pCDNA3.1(+)-Vector组、空白对照组、siRNA-NC组、siUC001kfo.2组图3 UC001kfo影响Hela细胞EMT相关蛋白表达

3 讨 论

宫颈癌是生殖系统好发的恶性肿瘤,高发人群越来越趋于年轻化〔6〕,有近99.7%已确诊宫颈癌患者患有HPV感染〔7〕,在辅助因素中,低社会经济地位、高生育率、多个性伴侣等均与宫颈癌的危险因素有显著相关性〔8,9〕,此外,基因表达紊乱也起关键调控作用〔3〕。早期宫颈癌临床治疗效果较好,晚期宫颈癌预后较差,转移和复发是病死的重要原因〔10〕,故以基因水平为出发点,研发新型用于宫颈癌诊治的临床生物标志物,使分子靶向治疗在临床上得到进一步完善。

长链非编码RNA(lncRNA)是非编码RNA的子集,缺乏保守的开放阅读框架,不能编码蛋白质〔11〕,研究显示,lncRNA参与许多生物学和病理过程并发挥关键调控角色〔12〕。恶性肿瘤细胞的形成伴有大量基因紊乱,除了蛋白质编码基因外,lncRNA也通过抑癌或促癌途径参与众多恶性肿瘤的进展〔13〕。UC001kfo是Pan等〔14〕从肝癌组织中筛选出来的一种lncRNA,该基因位于染色体Chr10(q3.31),共2 043 bp,通过体内外实验发现UC001kfo在肝癌中显著高表达,促进肝癌细胞的增殖与转移。与之相反,UC001kfo在乳腺癌中起抑癌作用,其原因可能与不同肿瘤细胞所处微环境不同有关〔4〕。因此本研究推测,UC001kfo也可能通过抑癌或致癌途径参与宫颈癌进展。本实验推测UC001kfo可能在宫颈癌进展中起促癌作用,可能促进HeLa细胞的增殖与转移。

α-SMA是一种参与细胞运动和维护的肌动蛋白,也是参与细胞骨架的主要成分之一。α-SMA表达阳性的肌纤维母细胞能分泌基质蛋白和尿凝血酶原激活物、胰岛素样生长因子-Ⅱ等细胞因子,促进肿瘤细胞的增殖和转移。有研究发现〔15〕,UC001kfo和α-SMA在染色体上存在部分重叠位点。本研究也通过RT-PCR验证这一结论,在转染48 h后的各组HeLa细胞中,UC001kfo与α-SMA的表达量呈正相关。α-SMA参与EMT过程,肿瘤细胞能穿透基底膜到达间质,完成EMT过程,经淋巴转移和血行转移至其他脏器,对恶性肿瘤的转移及进展起关键作用〔16〕。在此过程中,上皮细胞极性丧失,迁移和运动能力增强,同时上皮表型丢失而逐渐获得间质表型。伴随表型变化,许多基因的表达发生了改变,上皮表型相关蛋白如E-cadherin下降,间质表型相关蛋白如Vimentin、α-SMA等含量上升,同时一系列转录因子表达也发生变化。本研究提示,UC001kfo对宫颈癌HeLa细胞的EMT过程具有促进作用。

综上所述,UC001kfo在宫颈癌HeLa细胞中显著高表达,能促进HeLa细胞的EMT过程,从而参与肿瘤细胞的侵袭与转移。因此UC001kfo可能在宫颈癌的进展中发挥促癌的调控角色,可能是新型用于宫颈癌诊治的临床生物标志物,为进一步完善分子靶向治疗提供一定实验依据。此外,关于UCOO1kfo与α-SMA的协同关系及调控途径仍需进一步验证和研究,今后我们将继续以此展开实验研究,提供治疗宫颈癌更有效的凭据。