殷金成 刘洪新 顾燕青 唐新宇 郭宗保 沈俭

(上海交通大学医学院附属新华医院崇明分院,上海 202150)

膀胱癌是泌尿系统中最常见的恶性肿瘤之一,发病率以男性居多,其发病率和死亡率随着年龄的增长而逐渐升高,在因癌症死亡人群中所占比例为2.1%〔1〕。尽管治疗技术不断进步,但仍有约40%非肌肉浸润性膀胱癌患者在5年后进展为肌肉浸润性膀胱癌,且5年生存率只有60%〔2〕。膀胱癌的高复发率和死亡率是有待解决的临床问题,目前临床上的药物治疗效果不尽理想,且毒副作用较多〔3〕。三叶青是一种具有清热解毒、祛风化痰、活血止痛等功效的中草药,且有抗肿瘤和保肝效果,其块茎内含有的黄酮类化合物称为三叶青总黄酮(TFTH),具有抗肿瘤活性。有研究认为TFTH可通过信号通路诱导人宫颈癌细胞的凋亡〔4〕。信号转导与转录激活因子(STAT)3来源于胞质蛋白家族,具有促进细胞增殖和抑制细胞凋亡的双重效应,其持续激活可导致细胞的自发性生长和细胞恶性〔5〕。本研究探讨TFTH对膀胱癌细胞凋亡的影响及其对STAT3信号通路的作用机制。

1 材料与方法

1.1TFTH的提取 选择三叶青块根2 000 g,通过碱性稀醇提取法〔6,7〕得到三叶青总黄酮10 g,聚酰胺层析后,乙醇洗脱后真空干燥,取样品2 mg,加入20 μl二甲基亚砜(DMSO)使其充分溶解,制备得1.0×105mg/L的储备液,-20 ℃冰箱储存备用。使用时可用完全培养基稀释成相应浓度。

1.2膀胱癌细胞 人膀胱癌细胞株BIU-87购自南京海克尔生物科技有限公司(从美国ATCC细胞库引进)。使用DMEM培养基,包括10%胎牛血清(FBS)、1%A-A(100 U/ml青霉素-100 U/ml链霉素),放在37 ℃、5%CO2培养箱中孵育,细胞生长至80%左右时传代培养,传至第三代用于以下试验。

1.3细胞对数试剂盒(CCK)8试验 使用CCK8(美国,MCE)检测TFTH对癌细胞增殖的影响,BIU-87细胞生长到80%融合时胰酶消化、计数、重悬,将细胞悬液进行稀释至密度1×104个/ml。根据加入的TFTH稀释液浓度(0、20、50、100 μg/ml),分成4组,每组设5个复孔,同时设置参照孔(培养基、药物),分别将细胞悬液100 μl/孔种入96孔板中,细胞贴壁后,加入相应浓度的TFTH,放于孵箱中培养24、48 h后,取出每孔添加10 μl CCK8试剂,继续孵育1 h,取出于酶标仪450 nm处测定吸光度(OD)值,用实验组OD值减去空白组OD值得出最终OD值,重复3次。

1.4细胞凋亡检测 分别用不同浓度TFTH处理BIU-87细胞后,置于预冷的组织培养液中,并用双蒸水清洗。将300目尼龙网扎在小烧杯上,将BIU-87细胞液放在网上,边搓边以磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗,直至将细胞液搓完。收集细胞悬液,500 r/min离心后弃其上清,并用生理盐水洗两次,BIU-87细胞计数总数不少于1×106个/L细胞。吸取细胞悬液100 μl至1.5 ml EP管中,加入膜联蛋白(Annexin)Ⅴ/碘化丙啶(FITC) 5 μl和20 μg/ml PI溶液10 μl,孵育15 min,加入PBS 400 μl,流式细胞仪检测。

1.5Western印迹检测Janus蛋白酪氨酸激酶(JAK)2、STAT3、B细胞淋巴瘤(Bcl)-2相关X基因(Bax)、血管内皮生长因子(VEGF)和转化生长因子(TGF)-β1蛋白表达 收集不同浓度TFTH处理24 h后的BIU-87细胞,用RIPA蛋白裂解液适量提取细胞总蛋白,二喹啉甲酸(BCA)法定量蛋白,参照碧云天试剂盒说明配制10%浓度的胶,每孔道加总蛋白40 μg,100 V恒压电泳2 h,蛋白分离后在100 V恒压下转膜1.5 h,转好的膜用5%脱脂奶粉室温条件封闭1 h,将膜与一抗(均按照1∶1 000稀释的JAK2、STAT3、Bax、VEGF和TGF-β1抗体),4 ℃孵育过夜,洗膜,室温孵育辣根过氧化酶(HRP)标记的二抗1 h,洗膜,电化学发光(ECL)显色,磷酸甘油醛脱氧酶(GAPDH)蛋白为内参,ImageJ软件分析各蛋白与内参的灰度值比值。实验重复3次。

1.6统计学分析 采用SPSS22.0软件进行独立样本t检验。

2 结 果

2.1不同浓度TFTH组对BIU-87细胞增殖的影响 CCK-8检测结果显示,20、50、100 μg/ml的TFTH处理BIU-87细胞24或48 h后,对癌细胞增殖均有明显抑制作用(P<0.01)。见表1。

表1 不同浓度TFTH对BIU-87细胞增殖、凋亡及相关蛋白表达的影响

2.2不同浓度TFTH对BIU-87细胞凋亡的影响 20、50、100 μg/ml的TFTH处理BIU-87细胞24或48 h后,均有明显诱导癌细胞凋亡作用(P<0.01)。见表1。

2.3各组JAK2、STAT3、Bax、VEGF和TGF-β1蛋白表达 经20、50、100 μg/ml TFTH处理后BIU-87细胞,其JAK2、STAT3、VEGF和TGF-β1蛋白表达均明显降低,Bax蛋白表达明显升高,且呈浓度依赖性(P<0.05)。见表1、图1。

1～4:0 μg/ml组、20 μg/ml组、50 μg/ml组、100 μg/ml组图1 Western印迹检测各组蛋白表达

3 讨 论

膀胱癌是泌尿系统发病率最高的恶性肿瘤,其病因复杂,与环境因素、遗传因素、接触芳香胺、吸烟等因素均有关。目前的临床治疗手段主要以手术和化疗为主,但治疗效果常不理想,术后复发率高。TFTH是中草药中的黄酮类化合物,其功效可抑制肿瘤细胞增殖和诱导肿瘤细胞的凋亡〔8〕。有研究报道,TFTH可通过调节丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路诱导人肺癌A549细胞凋亡〔9〕;此外还有研究认为人肝癌HepG2细胞S期可被TFTH阻滞并具有诱导凋亡的作用〔10〕。JAK2/STAT3信号通路是细胞因子信号传导的重要途径,参与细胞多个生理过程,与肿瘤的发生、发展密切相关〔11〕。已有研究发现,JAK2/STAT3信号通路参与前列腺癌、结肠癌、乳腺癌等多种癌细胞的增殖和凋亡,在癌细胞的浸润和转移中扮演重要角色〔12,13〕。本研究结果显示,不同TFTH (20、50、100 μg/ml)浓度对BIU-87 细胞进行处理后,有明显抑制癌细胞增殖和促进细胞凋亡的作用,且随着TFTH浓度升高效果越明显。

JAKs、STATs 家族在各类细胞和组织中广泛分布,JAK2/STAT3信号通路在调控细胞增殖、分化和凋亡方面具有重要作用,其异常活化会引起细胞增殖过快、过多和恶变〔13〕。Western印迹表明,不同浓度TFTH明显抑制膀胱癌细胞内JAK2和STAT3表达水平,并与剂量浓度相关,因此通过抑制STAT3表达有望开发成为治疗膀胱癌的新靶点〔14,15〕。

有研究表明,肿瘤的产生和进展与TGF-β1、VEGF有关,TGF-β1、VEGF表达升高可抑制免疫细胞的增殖,有助于膀胱癌细胞的免疫逃逸〔16〕。此外,STAT3和Snail-Smad3/TGF-β1信号通路协同诱导肝癌细胞迁移或侵袭,而AG490 具有抑制 STAT3 磷酸化、降低p-Smad3蛋白水平从而减少肝癌细胞迁移或侵袭的作用,逆转免疫抑制〔17〕。本研究结果发现,TFTH具有相似的功效,能显著抑制STAT3、TGF-β1、VEGF在膀胱癌细胞BIU-87中的表达,因此可增强机体对癌细胞的免疫反应,从而抑制癌细胞增殖和促进细胞凋亡。Bax是Bcl-2的家族成员之一,其主要作用是促进细胞凋亡。多项研究显示,膀胱癌细胞的凋亡与磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/Bcl-2/Bax信号通路表达有关,上调Bax表达和下调Bcl-xL、Bcl-2表达可诱导促进膀胱癌细胞的凋亡〔18,19〕。本研究结果显示,TFTH能有效提高Bax蛋白表达水平,从而诱导膀胱癌BIU-87细胞的凋亡。总之,JAK2/STAT3信号通路的活化异常参与多种肿瘤的发生和发展,引起细胞与组织的恶变,出现肿瘤细胞凋亡异常、细胞周期失控、免疫逃避、侵袭转移等〔20〕。因此,以JAK2/STAT3信号通路作为靶位治疗膀胱癌有广泛的应用前景。本实验的不足在于对TFTH的作用研究还处于体外试验阶段,需要体内试验来验证本研究结果。