张月月 王君明,2 崔瑛

(1河南中医药大学药学院,河南 郑州 450046;2呼吸疾病中医药防治省部共建协同创新中心)

雷公藤红素为卫矛科雷公藤属及南蛇藤属植物(如雷公藤、南蛇藤、昆明山海棠)中所含的一个重要的三萜类化合物〔1,2〕,具有抑制肺癌、食管癌、乳腺癌等广谱抗癌活性〔3～5〕。槲皮素为金钱草、枸杞子、菟丝子、淫羊藿等中药所含的一个重要黄酮类化合物〔6～10〕,具有保肝、保肾、改善前列腺炎等广泛的生物活性〔11～14〕。同时含有雷公藤红素与槲皮素这两个单体物质可共见于一些临床制剂如昆仙胶囊〔15〕(主要由昆明山海棠、枸杞子、菟丝子、淫羊藿组成),也可见于减毒增效的现代研究如复方雷公藤汤〔16〕(含雷公藤与金钱草)。本文前期已证实了含有这两个单体成分的雷公藤与金钱草饮片配伍对高危害性的肺癌、食管癌均有抗癌增效作用〔17,18〕。本研究首次从成分配伍层面,考察雷公藤红素联合槲皮素对肺癌和食管癌的抗癌增效作用,为雷公藤红素与槲皮素的科学合理联用提供初步的临床前实验证据。

1 材料与方法

1.1细胞株 人肺癌细胞株A549、食管癌细胞株Eca9706均由河南中医学院分子生物学实验中心提供。

1.2主要试药 雷公藤红素购于上海金穗生物科技有限公司,纯度≥98%(HPLC),批号:131106;槲皮素购于上海金穗生物科技有限公司,纯度≥98%(HPLC),批号:K121228。RPMI1640(Gibco公司);胎牛血清(HyClone公司);四甲基偶氮唑蓝(MTT,Amresco公司);二甲基亚砜(DMSO,Amresco公司);胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(EDTA)消化液(0.25%)含酚红(Solarbio公司)。

1.3主要仪器 酶标仪(BioTek ELx800uv);紫外分光光度计(BioMate);Heraeus细胞培养箱(德国Kendro);倒置显微镜(ZESS);SG-603生物安全柜(Bake);Milli-Q Advantage A10型超纯水机(Millipore);3-18K高速冷冻离心机(Sigma);TDL-40B台式离心机(上海安亭科学仪器厂);XK96-B涡流混合器(姜堰市新康医疗器械有限公司);BS210S型电子天平(北京塞多利斯天平有限公司);DZF-6020真空干燥箱(上海精宏实验设备有限公司);RE-52AA旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂);HH6数显恒温水浴锅(上海比朗仪器有限公司)。

1.4细胞培养 细胞于含10%胎牛血清的RPMI1640培养液中,置于37 ℃、5% CO2培养箱,每间隔48 h更 换1次培养基,实验时细胞用消化液(0.02% EDTA和0.25%胰蛋白酶以1∶1比例配制)进行消化,并接种于96孔板中。

1.5MTT法测定细胞增殖抑制率 细胞以1×104/孔接种96孔培养板,于37 ℃、5% CO2培养箱培养24 h。设对照组、不同浓度雷公藤红素(0.25、1.25、2.50、5.00、10.00、20.00 μmol/L)组及不同浓度雷公藤红素与槲皮素配伍组。参考研究〔19〕,槲皮素对A549、Eca9706细胞的IC30值分别为82.7、104.8 μmol/L。每组3个复孔,继续培养48 h,去除培养上清,每孔加入0.5 mg/ml的MTT 100 μl,继续培养4 h,小心吸去上清,并加入150 μl DMSO溶解紫色沉淀,用酶标仪在波长为570 nm/630 nm,测定光密度D(λ)值。抑制率(%)=〔1-D(λ)实验孔/ D(λ)对照孔〕× 100。

1.6统计学方法 采用SPSS11.5软件进行单因素方差分析、t检验并计算半数抑制浓度(IC50)和30%抑制浓度(IC30)。

2 结 果

2.1雷公藤红素及其配伍槲皮素抑制A549、Eca9706细胞增殖 雷公藤红素浓度1.25、2.50、5.00、10.00、20.00 μmol/L时对人肺癌A549及浓度2.50、5.00、10.00、20.00 μmol/L时对人食管癌Eca9706细胞增殖均有显著抑制作用(P<0.05,P<0.01),且呈剂量依赖性。配伍IC30槲皮素后,雷公藤红素在0.25、1.25 μmol/L使人肺癌A549细胞增殖抑制率显著升高(P<0.01),而在其他更高浓度时,配伍槲皮素后抑制率均无显著差异(P>0.05);配伍IC30槲皮素后,雷公藤红素在0.25、1.25及2.50 μmol/L时,人食管癌Eca9706细胞增殖抑制率均显著升高(P<0.01,P<0.05),而在其他更高浓度时,配伍槲皮素后抑制率均无显著差异(P>0.05)。见表1。

表1 雷公藤红素对人肺癌A549细胞、食管癌Eca9706细胞增殖抑制率的量效关系及配伍槲皮素前后两种癌细胞增殖抑制率的比较

2.2雷公藤红素配伍槲皮素前后细胞的IC30、IC50值 雷公藤红素对A549、Eca9706细胞的IC50为4.687、4.939 μmol/L,IC30为1.774、1.989 μmol/L;配伍IC30槲皮素后,雷公藤红素对A549、Eca9706细胞的IC50分别降低至2.064、2.040 μmol/L,IC30分别降低至0.337、0.408 μmol/L。表明配伍槲皮素对雷公藤红素的抗癌药效起到了协同增效作用。

3 讨 论

以雷公藤红素为重要活性成分的中药(如昆明山海棠、雷公藤)和以槲皮素为重要活性成分的中药(如枸杞子、菟丝子、淫羊藿、金钱草)配伍,常可组方昆仙胶囊〔15〕(主要由昆明山海棠、枸杞子、菟丝子、淫羊藿组成)、复方雷公藤汤〔16〕(含雷公藤与金钱草)应用。本文之前的研究已经从饮片配伍层面证实雷公藤与金钱草配伍对人肺癌A549和食管癌Eca9706细胞增殖具有抗癌增效作用〔17,18〕。MTT法是体外生物活性评价最常用的研究方法之一,已被广泛应用于抗肿瘤等多种生物活性的研究和评价,尤其适合于对单体成分活性的评价〔18～21〕。本研究结果表明,配伍槲皮素对雷公藤红素对人肺癌A549及食管癌Eca9706细胞具有明显的抗癌协同增效作用且雷公藤红素的抗癌增效作用呈现出一定的量效关系。进一步从体内实验层面考察雷公藤红素配伍槲皮素的抗癌增效作用及其机制,将是后续研究的重要方向。