李雯,肖小丽,龚艺,曲伟红,赵建国,姜登钊,何刚

(九江学院 药学与生命科学学院,江西 九江 332005)

香加皮和五加皮均为常用的具有利水消肿、祛风湿功效的传统中药。香加皮习称“北五加皮”,来源于萝藦科植物杠柳PeriplocasepiumPunge.的干燥根皮,五加皮习称“南五加皮”,来源于五加皮来源于五加科细柱五加AcanthopanaxgracilistylusW.W.Smith 的干燥根皮[1]。二者来源不同,而且化学成分、功效和药理作用不完全相同[2-3],但外形性状观彼此相似,容易混淆。而市场上人们常混淆香加皮、五加皮和地骨皮,导致相互替代使用较为广泛[4-5]。这对药材的鉴别和临床合理正确使用造成困难。文献常采用鉴别方法有性状鉴别、显微鉴别、薄层色谱法[1]、高效液相色谱法[6-7]、DNA条形码技术[8]和HS-SPME-GC-MS法[9]等,未见采用红外光谱法鉴别香加皮和五加皮的文献报道。红外指纹图谱能反映中药中化学成分组成及其含量的整体信息,具有操作简单、快速而无损伤等特点,现已广泛用于药材真伪鉴别、道地性识别和中药配方颗粒的质量控制[10]等领域。拟采用红外光谱结合聚类分析法和双指标分析法对香加皮和五加皮样品分析。

1 材料与方法

1.1 仪器与材料

1.1.1 仪器

傅立叶变换红外光谱仪(VERTEX 70,Burker公司),手提式中药粉碎机(SL-100,浙江省永康市松青五金工具厂),电热恒温干燥箱(DHG-9145A,上海一恒科学仪器有限公司),电子分析天平(BT-224S,赛多利斯科学仪器有限公司)。

1.1.2 材料

22批药材(S1样品为生药学实验室留存8年的样品,其他样品均购买于市场上不同的药店和药材公司,贮存时间在使用日期之内,样品信息见表1,经曲伟红副教授生药鉴定);溴化钾(KBr,光谱纯)。

表1 样品来源信息

1.2 实验方法

1.2.1 样品制备

取样品于60 ℃干燥5 h后,粉碎,过200目筛(孔径:0.074 mm)。取适量细粉与KBr粉末(质量比约为1∶150)压片。

1.2.2 红外光谱测定

扫描范围4 000～400 cm-1,分辨率4 cm-1,灵敏度5,扫描次数32次,基线校正和归一化处理,去除水分和CO2的干扰,得到一维红外指纹图谱和吸收峰数据。二阶导数红外光谱图和吸收峰数据采用红外光谱仪自带OPUS红外分析软件获得,平滑点为32,灵敏度为2。

1.3 数据处理

1.3.1 聚类分析法

提取1 800～400 cm-1范围内吸收峰的位置和吸收强度明显差异的波段区间透光率值,作为聚类分析的原始数据,采用OriginPro.v8.6.SR3软件进行系统聚类分析。

1.3.2 双指标序列分析法[11]

共有峰率P=(Ng/Nd)×100%,变异峰率Pva=(Na/Ng)×100%,变异峰率Pvb=(Nb/Ng)×100%。其中:Ng是共有峰,红外指纹图谱中都出现的吸收峰;Nd是独立峰:在红外指纹图谱中所有出现的不同吸收峰,Na和Nb分别是图谱a和b的变异峰,指纹图谱a或b中相对于其共有峰的非共有峰数。

2 实验结果与讨论

2.1 方法学考察

2.1.1 精密度试验

分别取S1和S9样品片,连续扫描5次,同一样品所得图谱基本一致,以共有峰波数计算,相关系数均大于0.999 8,RSD均小于1%。

2.1.2 重复性试验

分别取S1和S9样品,各制备5片样品片进行扫描,同一样品所得图谱基本一致,以共有峰波数计算,相关系数均大于0.999,RSD均小于2%。

2.1.3 稳定性试验

分别取同一份S1和S9样品片,每隔1 h测定一次,共4次,同一样品所得图谱基本一致,以共有峰波数计算,相关系数均大于0.999,RSD均小于5%,表明样品片在4 h内稳定。

2.2 样品一维红外指纹图谱结果

各样品的一维红外指纹图谱见图1,看出样品间红外光谱图整体的峰形和峰位较相似,但在1 800～400 cm-1范围内指纹图谱差异较明显。

图1 样品的一维红外指纹图谱

所有样品的共有峰高达10个(共有峰的确定见2.4.1项下),分别是3 422(3 386),2 924(2 937),1 622,1 375,1 318,1 264(1 243),1 152,1 025,778(781)和528(518)cm-1。香加皮正品还有3个共有峰,分别是2854,1 737和1 428 cm-1,除S1外均另有1 516,860和578 cm-1处3个吸收峰;五加皮正品还有5个共有峰,分别是1 514,1 080,859,662和577 cm-1;地骨皮正品还有4个共有峰,分别是3 348,3 070,1 444和666 cm-1。混伪品具有正品的部分或全部吸收峰。

3 500～3 200 cm-1的峰强而宽,为O-H、N-H伸缩振动峰。2 924 cm-1为亚甲基的C-H伸缩振动峰,1 622 cm-1可能是C=C(烯烃或苯环骨架)、C=O的伸缩振动峰或者酰胺I带吸收峰,1 514 cm-1属于苯环骨架振动,1 375 cm-1为甲基和亚甲基C-H的弯曲振动峰,1 318 cm-1属于C-O或C-N伸缩振动的特征峰,1 264(1 243)cm-1属于C-O(酚羟基、醇羟基等)的伸缩振动,或C-H的弯曲振动峰,1 152,1 025 cm-1属于C-O(酚羟基、醇羟基、内酯和醚)的伸缩振动峰,860,778(781) cm-1为糖环振动和 C-H面外弯曲振动峰。1 622,1 318和778(781)cm-1三尖峰分别是草酸钙中C-O反对称、对称伸缩振动和弯曲振动峰。1 152,1 080,1 025和860 cm-1处附近的阶梯峰是淀粉中C-O伸缩振动和糖环振动吸收峰。表明各药材化学成分组成具有相似性。

2 854,1 737,1 428cm-1处的3个吸收峰为香加皮正品的最重要的鉴别特征峰组,属于脂肪酸酯类成分的亚甲基的C-H和C=O(内酯)的伸缩振动峰以及C-H弯曲振动;1 080,860和664 cm-1处的3个吸收峰为五加皮的最重要鉴别指纹峰组,为糖环振动、C-H面外弯曲振动峰和芳环C-OH面内弯曲,其中1 080cm-1为水溶性多糖的C-O-C的伸缩振动;而 3 345、3 070和1 444 cm-1附近出现3个特征吸收峰为地骨皮的最重要鉴别特征峰组,分别为O-H或N-H、烯烃或芳香环C=C-H伸缩振动、苯环骨架振动或酰胺II带吸收峰[12]。由此可见,香加皮合格正品有机酸类、芳香化合物及其苷类成分特征明显,不合格品芳香性成分则明显降低。五加皮正品水溶性多糖(苷类)和有机酸类成分特征更明显[3]。而地骨皮正品中生物碱、烯烃、酰胺类和芳香化合物特征更明显[12]。此结果与文献报道香加皮主要的化学成分为 C21 甾体苷、强心苷、萜类、醛类、有机酸等,五加皮主要含有挥发油、三萜皂苷类和有机酸等成分结果相符[13-14]。

2.3 二阶导数红外指纹图谱结果

由于二阶导数光谱分辨率提高,峰尖锐程度增大,能将一维图谱中的肩峰和重叠峰区分,峰数量亦显著增多。香加皮和五加皮在4 000～400 cm-1范围内二阶导数红外指纹图谱均有29个较明显的吸收峰(见图2和图3)。尽管二者吸收峰的峰位很相似,但峰形差异明显,尤其是3 000～2 800 cm-1(峰1和2)、1 800～1 600 cm-1(峰3至峰6)和720～520 cm-1(峰22至峰27)的峰形、峰位和峰强度差异更明显,可作为鉴别依据。而S1缺乏1 664,1 600 cm-1,并1 578,1 027,1 006,593,551和442 cm-1处产生新吸收峰,进一步确认其芳香性成分含量明显下降。

峰1～29的峰位依次:2 922,2 852,1 743,1 664,1 621,1 600,1 513,1 462,1 423,1 372,1 319,1 238,1 160,1 108,1 080,1 054,990,923,888,781,718,668,644,620,576,518,467和432 cm-1。

峰1～29的峰位依次为:2 927,2 852,1 743,1 694,1 664,1 621,1 513,1 462,1 423,1 372,1 319,1 238,1 160,1 108,1 080,1 054,990,923,888,781,718,668,638,610,576,518,467和432 cm-1。

混伪品的峰形和峰位与正品较为相似(见图4),其中S22与香加皮正品图谱峰形基本一致,S19与五加皮正品图谱峰形基本一致,而S18、S20与地骨皮正品的图谱峰形更接近。

图4 样品S16-S22的二阶导数红外指纹图谱

2.4 聚类分析结果

由图1可知,样品中红外指纹图谱在1 800～400 cm-1范围内差异较明显,故提取该波段区间透光率值,作为聚类分析的原始数据进行系统聚类分析,结果见图5。当距离约为0.05时,可将样品分成四类:S1和混伪品S21,混伪品S22和香加皮正品S2～S8,混伪品S19和五加皮正品S9～S15,混伪品S18和S20和地骨皮正品S16和S17分别聚成一类。由此可见,聚类分析大体上能够将样品进行区分。

图5 样品聚类分析结果

2.5 双指标序列法结果

2.5.1 共有峰的确定

因为仪器的分辨率是4 cm-1,所以两个峰位相差8 cm-1以内的一组峰即为共有峰。在表2中,多数情况明显符合此原则,可以明确判断为共有峰。3 500～3 200 m-1范围的宽峰为N-H、O-H的伸缩振动峰,单峰的认为是同一个共有峰,出现双峰的属于两个共有峰。另从各样品指纹图谱峰形和峰位来看,两个峰位相差20 cm-1以上的一组峰属于独立峰。根据以上原则,确定表2中在同一列的吸收峰为共有峰。

表2 样品的一维红外光谱吸收峰数

2.5.2 共有峰率和变异峰率双指标序列

分别以各样品为参照,计算其他样品相对该样品的共有峰率和变异峰率,用(P,Pva,Pvb)表示,共有峰率越大,表示样品间的亲缘关系越近,而变异峰率越大,表示样品间发生的变异越大。按照共有峰率值排序得到22批样品的双指标序列如表3。

表3 一维红外指纹图谱共有峰率和变异峰率双指标序列分析结果 单位/%

香加皮正品(S1除外)间共有峰率为100%～83.33%,五加皮正品间共有峰率为100%～93.75%,而地骨皮正品间共有峰率为100%～82.3%[12]。香加皮、五加皮与地骨皮正品间共有峰率均小于72.22%。而混伪品与正品间的共有峰为93.75%～47.62%。

2.5.3 基本关系组、对及分析

根据建立的双指标序列,可以对22批样品进行基本的分组,在最相似样品对、组中,按共有峰率高低将它们分成3组:

A组:S2:S7(100,0,0),S4:S6S22(100,0,0),S5:S8,S9:S10S11S12S13S15S19(100,0,0)。

B组:S2S5S7S8:S4S6S22(94.12,6.25,0.00),S2S7:S5S8(88.89,6.25,6.25),S2S7:S27(88.24,13.33,0.00),S3:S4S6S22(88.24,6.67,6.67),S3:S2 S5S7S8S21(83.33,6.67,13.33),S3:S27 (82.35,14.29,7.14),S9S10S11S12S13S15S19:S14 (93.75,0.00,6.67),S16:S20 (93.75,0.00,6.67),S16:S17S18 S26 (82.35,7.14,14.29),S20:S18S26 (88.24,6.67,6.67),S23:S24S27 (93.75,6.67,0.00),S23:S26 (88.24,6.67,6.67),S24:S26 (93.75,0.00,6.67),S24:S14S20 (82.35,7.14,14.29),S24S25:S27 (87.50,7.14,7.14),S25:S4S6S22S23 (82.35,7.14,14.29),S26:S27 (82.35,7.14,14.29)。

C组:S1:S14S20 (55.00,36.36,45.45),S1:S9S10S11S12S13S15S19 (50.00,50.00,50.00),S1:S18 (47.62,50.00,60.00),S2S7S21:S17 (50.00,54.55,45.45),S3:S17 (52.38,45.45,45.45),S4S6S22:S16 (55.00,45.45,36.36),S4S6S22:S17 (45.45,60.00,60.00),S5S8:S14S26 (57.14,41.67,33.33),S5S8:S17 (43.48,70.00,60.00),S9S10S11S12S13S15S16S19:S25 (57.89,36.36,36.36),S9S10S11S12 S13S15S19:S17 (55.00,36.36,45.45),S16:S2S5S7S8 (52.38,36.36,54.55),S20:S2S5S7S8 (57.14,33.33,41.67),S21:S14S18 (57.14,41.67,33.33)。

在A组中,此组中S2与S7,S4与S6S22,S5与S8,S9与S10S11S12S13S15S19间共有峰率为100%,变异峰率0%,表明该组样品间共有峰率极高,变异峰率极低,样品间亲缘关系非常近。

在B组中,样品间的共有峰率为80%～95%,变异峰率为0%～15%,表明样品间的亲缘关系较近。该组样品主要来源于各正品样品间、正品与混伪品、混伪品两两比较。表明各正品样品可能受产地、气候、生长环境的影响,发生了微小的变化。混伪品与某些正品相似度较高。

C组中,共有峰率均很低(<58%),且变异峰率均较高(30%～70%)。该组样品主要是S1与其他样品、香加皮正品与地骨皮正品、五加皮正品与地骨皮正品之间的共有峰率和变异峰率情况。

结果表明香加皮合格正品间、五加皮合格正品间的亲缘关系很近,变异较小。但二者及其混伪品间的亲缘关系较远,发生了较大的变异。另外S1因为贮存时间长,其化学组成发生了明显的变化,导致与正品间共有峰率大大降低(72.22%～60.00%)。

3 讨论

在药材市场上,五加皮、香加皮和地骨皮常被混用,但它们之间的化学成分与药理作用有较大差别,香加皮甚至有毒。为确保药材的准确性,应制定合理的鉴别方法,以提高中药材的质控水平。本文首次采用傅里叶变换红外光谱法结合聚类分析法和双指标序列法比较了市售中药香加皮、五加皮和地骨皮样品,结果表明香加皮和五加皮合格正品的红外指纹图谱具有明显的特征,可以作为鉴别正品及其是否合格的依据。本实验建立的红外光谱法具有简便、快速和无损样品等优点,为香加皮、五加皮的鉴别提供了一种新方法,为其质量评价、制剂开发和临床合理用药提供参考。

根据香加皮、五加皮和地骨皮正品一维和二阶红外指纹图谱的峰形和峰位、聚类分析和双指标序列分析的结果,发现当作香加皮售卖的S18和S19的红外光谱特征与分别与地骨皮和五加皮正品相符,而当作五加皮售卖的S20和S22的红外光谱特征分别与地骨皮和香加皮正品相符,而S21的特征区域吸收峰则与香加皮正品特征符合,但指纹区的吸收峰发生了较大的变异。以上结果表明市售香加皮、五加皮与地骨皮有混用现象存在,与文献报道[4-5]结果一致。

皮类药材由于其药用部位特殊,受产地、生长环境、采收时间等影响较小,因而本实验所用的不同产地香加皮和五加皮的红外指纹图谱相似度很大。含挥发性成分较大的药材在因贮存时间较长而发生“走油”现象,影响了药品疗效,在质量控制和临床用药中应高度重视中药材的贮存时间,今后有待进一步研究贮存时间对光谱特征的影响。