金纳米颗粒的制备及其在电化学生物传感器中的应用进展

2023-10-08陈雪李昉刘树峰

山东化工 2023年16期

陈雪,李昉,刘树峰

(青岛科技大学化学与分子工程学院,山东青岛 266042)

近年来,以癌症为标志的很多重大性疾病对于人类健康生活的影响越来越大,因此对于某些核酸、蛋白质、肿瘤标志物的准确检测是十分必要的。结合各种生物策略的电化学传感器层出不穷,并且表现非常突出[1-2]。在电化学生物核酸传感器中,因其检测目标的微小,传感器所处的平台及介质也须是特定的环境,并且对平台的要求较高,比如Au电极、玻碳电极的表层面积的控制[3]。在另一方面,为了提高传感器的灵敏度与特异性,将纳米材料应用于传感器的制造,这也是基于各种物理材料的不断发展。研究发现,当某些材料的尺度缩小到纳米级别时,其中部分的物理性质与化学性质有着显著的改变,并且还会显现独特性能,可能是因为高表面积或量子效应引发的[4-5]。目前,随着电化学生物传感器与纳米材料的不断发展,它们可以很好地结合起来应用于生物传感器中用于更加灵敏准确地检测。

在电化学生物传感器中,除了各种生物放大策略(比如杂交链式反应、熵驱动、催化发夹组装、滚环扩增策略等)的应用,DNA自身的各种结构也有着无限可能。DNA的特殊物理化学性质可通过几种组装策略来形成高度可预测的结构,这些结构已被贯通在各个领域[6-7]。新的DNA结构设计工具的制备和应用使许多实验进程变得简单易操作,并使碱基数目多的和任意的DNA结构对于不同的应用变得可行。此外,DNA所形成的纳米结构被认为是生物医学应用中具有可编辑性和生物相容性的优异材料。传统来讲,DNA的自身纳米结构与生物放大策略相结合就可很好地制造传感器。为进一步提高传感器的灵敏度与特异性,引入纳米材料,将其生物功能化[8]。生物功能纳米材料近年来也应用了许多种类,其中金纳米颗粒(AuNPs)的许多特性值得我们去探究。

单质金(Au)是化学性质最稳定的元素之一,纳米尺寸级别的金除此之外还具有特殊的物理化学性质、光电性质以及生物相容性[9]。纳米材料(NMs)为环境、食品安全和临床诊断应用的电化学生物传感器提供了众多优势,包括实现了较低的检测限(LOD)。由于纳米材料具有较大的表面积和较高的负载能力,已有多种信号增强策略被报道利用纳米材料作为多种信号分子和生物识别元素的载体。由于许多纳米材料具有电化学活性(如金属纳米颗粒)。它们还被用作电活性示踪剂,以生产具有增强性能的纳米结构电化学传感器,并被用作催化剂,其表面具有现成的活性位点[10]。金纳米粒子(AuNPs)可能是生物传感器中使用最广泛的纳米粒子,因为它们的化学合成快速简单,具有形状控制和窄尺寸分布、生物相容性以及易于生物结合。在电化学生物传感器方面,AuNPs因其独特的电化学特性而引起了人们的特别兴趣,这使得各种生物传感器的开发成为可能。因此,在众多的纳米材料中,金纳米颗粒(AuNPs)是科研工作者研究最多的,在生物传感、疾病诊断、医疗等方面有着很好的应用前景。金纳米颗粒的制备及特性我们还需继续深入探究,其在生物传感器中的应用已经成为放大信号的一种常用手段。

1 金纳米颗粒(AuNPs)的制备

柠檬酸三钠还原四氯金酸:将200 mL的0.01%的HAuCl4溶液搅拌煮沸后,将5 mL的1%柠檬酸三钠溶液快速加入煮沸的溶液中。当溶液变成深红色,表明金纳米颗粒的形成,此时将溶液继续搅拌并冷却,得到稳定的金纳米胶体。后续对于金纳米颗粒的表征,对于纯度,在紫外-可见光范围内出现一个特定位置的特征峰即可证明金胶的完好制备,再根据其吸光度(朗伯-比尔定律)就可计算金纳米颗粒的浓度。透射电镜下其形状更直观一点。上述0.01%的HAuCl4溶液与1%柠檬酸三钠溶液的比例所制得的金纳米颗粒粒径较小,其不同的比例所形成的粒径大小是不同的,根据实验状况进行调整。

2 金纳米颗粒的性质[11]

2.1 电化学特性

金本身就具导电性,纳米金也有着良好的导电性,可增强原本电极的导电性。因其电化学特性,AuNPs更多地适用于电化学生物传感器。

2.2 易于表面修饰

一方面,体积更小,比表面积更大;最重要的是,金达到纳米尺寸后,颗粒表面总是覆有一层保护剂分子,就可利用分子间的相互作用将这些分子与特定的试剂反应,以得到想要修饰的基团或环境。还可用作催化剂,在其表面上具有现成的活性位点。因此,金纳米颗粒可以较容易地被多种分子修饰,被应用于生物传感器中,并将其功能和应用扩展到化学分析、生物医学等领域中。

2.3 局部表面等离子体共振(SPR)

AuNPs表面的特殊性(带有自由电子),会在入射光的作用下形成表面等离子体共振效应,在紫外-可见光范围内会出现一个特征峰。合成金纳米颗粒后,只需紫外表征就可判断是否制备成功,验证AuNPs上修饰DNA是否成功也可用此方法(若DNA修饰成功后,其体积会略增大,与AuNPs自身的出峰位置相比会向长波长方向移动)。由于金纳米颗粒间等离子体激元耦合效应,金纳米颗粒之间的分散与聚集过程会伴随从红色到蓝色的颜色变化,这是肉眼就可观察到现象,盐度等许多环境变化都会影响金纳米颗粒的聚集与分散程度,成为开发比色生物传感器的通用范例。

3 金纳米颗粒在电化学生物传感器中的应用

金纳米颗粒(AuNPs)可能是生物传感器中使用最广泛的纳米粒子,因为它们的化学合成快速简单,具有形状和窄尺寸分布可控性、生物相容性和易生物结合性。对于电化学生物传感器而言,AuNPs因其独特的电化学特性,使得各种生物传感器的开发成为可能。迄今为止制造的大多数基于AuNPs的电化学生物传感器都报道了AuNPs作为电化学标记或分析物受体的载体,或作为电极表面的改性剂的用途,通常与聚合物和石墨烯结合或与其他纳米材料结合。

3.1 金纳米颗粒与碳纳米管的结合用于超灵敏电化学DNA生物传感器的制造

纳米材料已广泛应用于电化学生物传感系统,用于高灵敏度和高选择性地检测各种生物目标。金纳米颗粒自身就具有独特优势,还可与其他纳米材料结合协同放大信号。基于“海胆状”碳纳米管-金纳米颗粒(CNT-AuNPs)纳米团簇,Han等人[12]开发了一种简单、无标记、超灵敏的三明治型电化学DNA生物传感器,用于DNA检测时的信号放大(如图1所示)。具体来说,多巴胺(DA)的电化学聚合被用于修饰金电极,通过席夫碱反应将胺基修饰的探针DNA (NH2-ssDNA)共价连接到聚多巴胺(PDA)功能化的金电极表面来制备DNA生物传感器,其中PDA的茶酚官能团与胺基修饰的DNA偶联,以将DNA探针锚定在PDA的界面上。此时为无靶的状态,即原始状态。当有靶标(T-DNA)存在时,通过与P-DNA杂交,暴露出一个位点,将双链DNA功能化的AuNPs引入传感器中。之后,末端修饰的单壁碳纳米管通过位点与DNA杂交连接到金纳米粒子表面,形成三维放射状纳米团簇,产生显著的电化学响应。由于DNA链的柔性、相对大质量的AuNPs和共轭CNT的大接触表面积,CNT-AuNPs纳米簇被定位在金电极表面附近,有着非常高效的电子转移。所以,利用简单的电化学表征:循环伏安法(CV)、电化学阻抗谱(EIS)和线性扫描伏安法(LSV),就可对DNA生物传感器的制备过程和性能进行可行性的验证。由于碳纳米管-金纳米颗粒具有更大的接触表面积和超电子导电性,这种新设计的3D DNA纳米结构显示出对DNA的超灵敏检测,检测极限为5.2 fM (线性范围为0.1 pmol/L至10 nmol/L),以及在最优环境下区分单错配DNA和完全匹配的目标DNA的高选择性。这种生物传感器结合了碳纳米管和金纳米粒子的协同特性,展现出了高准确性、强特异性的信号放大策略,用于实现对DNA检测和诊断应用的灵敏电化学生物传感器。

图1 电化学DNA生物传感器的制造和检测过程示意图

3.2 金纳米颗粒应用于电化学生物传感器中以提高灵敏度

金纳米粒子(AuNPs)已经被开发应用于电化学生物传感器中,由于单个金纳米颗粒几乎都会装载数百条DNA链,这为靶标的检测提供了显著的扩增。再结合其他策略,待测靶标就可被特异性地检测到,检测限相对较低。Ge等人[13]设计了一种无需聚合酶链式反应(PCR)扩增的簇状规则间隔短回文重复序列(CRISPR)/Cas12a介导的双模式电化学生物传感器(图2),用于检测转基因大豆SHZD32-1。合成了功能化的复合生物纳米材料Fe3O4@AuNPs/DNA Fc&Ru作为信号单元,选择SHZD32-1的特征基因片段作为靶DNA (tDNA)。当Cas12a、crRNA和tDNA同时存在时,形成了三元复合物Cas12a-crRNA-tDNA,并且激活了CRISPR/Cas12a系统对单链DNA的非特异性切割能力。因此,信号单元中的单链DNA-Fc被切割,导致二茂铁(Fc)的快速扫描伏安(FSV)信号的降低和被Fc抑制的钌络合物(Ru)的电化学发光(ECL)信号的增加。AuNPs的加入使得信号数倍扩增,检测限达到预期的效果。其中,ECL和FSV的线性范围分别为1～107 fM/L和10～108 fM/L,ECL和FSV的检测限分别为0.3 fM/L和3 fMl/L。准确度、精密度、稳定性、选择性和可靠性均令人满意。此外,无PCR检测可在室温下一小时内完成,无需复杂的操作和样品处理,在转基因作物的实际应用检测中显示出巨大的潜力。并且可以有助于开发更加环境友好的基于AuNPs的电化学生物传感器。且由于电化学发光(ECL)和快速扫描伏安(FSV)信号可以交叉验证,因此准确度和可靠性很高。这种生物传感器为高灵敏度、精确和特定的转基因生物现场检测提供了新的解决方案,并为CRISPR/Cas12a系统在传感器开发中的应用提供了新思路。对于以上无生物扩增策略的电化学生物传感器的制造,AuNPs是扩增信号中的重要组成部分。

图2 用于转基因大豆无PCR检测的CRISPR/Cas12a介导的双模式电化学生物传感器示意图

综上所述,基于CRISPR/Cas12a系统开发了一种用于检测转基因大豆的双模式电化学生物传感器,该传感器具有以下显著优势:(1) 高灵敏度,检测限低至0.3 fM/L,可检测低浓度转基因成分;(2) 高选择性,普通干扰不会影响检测;(3) 准确度高,相对标准偏差不超过114%和11%;(4)高信赖性,ECL和FSV信号可以交叉验证,可避免假阴性或假阳性结果;(5)简单的实验步骤,只要制备好传感器,检测就可一步完成;(6) 温和的实验环境,可在室温下进行,无需PCR扩增;(7) 反应时间短,可在1 h内完成。因此,这种双模式电化学生物传感器在转基因作物及产品的快速检测领域具有良好的应用潜力。

3.3 金纳米颗粒(AuNPs)制造的电化学DNA传感器用于多核苷酸激酶的检测

金纳米颗粒因其良好的导电性被广泛应用,又因其体积小,比表面积大,和其他的生物纳米材料结合在电化学生物传感器中应用有着更优的效果。T4多核苷酸激酶(PNK)活性的测定和PNK抑制剂的筛选对于疾病诊断和药物发现至关重要。已经应用了许多电化学策略用于PNK活性和抑制的灵敏测量,然而之前的策略中经常会有其他的分子标记和电化学读出的检测过程的多个步骤。在此展示了一种电化学DNA (E-DNA)传感器,用于一步检测PNK,具有“信号开启”读出功能,不需要额外的分子标记修饰。在面图3中,Lin等人[14]设计了高度可切换的双链DNA (dsDNA)探针被固定在金纳米粒子修饰的二硫化钼纳米材料(MoS2-AuNPs)上,该纳米材料具有大表面积和高电导率,用于提高PNK检测中的信号增益。这种集成了MoS2-AuNPs的“Signal-ON”E-DNA传感器比没有MoS2-AuNPs的传感器具有更高的灵敏度,检测极限为2.18×104U/mL。此外,该体系的分析结果显示出高选择性,能够将PNK与其他酶和蛋白质区分开,并可用于筛选抑制剂。MoS2-AuNPs已被广泛用作电极修饰材料,以提高小分子、蛋白质和核酸的超灵敏检测的导电性。该传感器结合了电化学DNA传感器和MoS2-AuNPs的优点:(1) E-DNA传感器易于制造,能够以高灵敏度直接检测复杂样品中的PNK,显示出临床应用的潜力;(2) 与报道的具有最大信号抑制限制的“Signal-OFF”生物传感器相比,该传感器产生的“Signal-ON”电化学信号更稳定;(3) 一步和无试剂的便利性和信号稳定性使得传感器能够实时监测PNK的活性;(4) MoS2-AuNPs不仅可以提供有效的DNA固定面积,而且加快电化学标记分子的电子传递,增强法拉第电流,从而提高PNK检测的灵敏度。经实验证明,这种E-DNA传感器可以灵敏地检测缓冲液和细胞裂解液中的PNK,筛选PNK抑制剂,并可以进一步用于疾病诊断和药物发现。