吕秀玲,赵世娟,章晓骅

(南京正大天晴制药有限公司,江苏 南京 210046)

羟乙基淀粉( Hydroxyethyl starches,HES) 是以糯玉米或马铃薯支链淀粉为原料,经轻度酸解和醚化反应后,葡萄糖被羟乙基化的合成多糖,其结构与糖原类似,可经内源性α-淀粉酶逐级降解,至相对分子质量低于肾阈值( ≤70 000 )后,经肾脏直接代谢排出。羟乙基淀粉130/0.4为第三代羟乙基淀粉,因其具有更低的相对分子质量(130 000±20 000)和更低的取代度(0.36～0.45),有效增加了体内代谢消除速率,降低肾功能损伤[1-2]。以羟乙基淀粉 130/0.4 制成的注射液为血液容量扩充剂,用于治疗和预防血容量不足,急性等容血液稀释(ANH)。5-羟甲基糠醛(5-HMF)是由葡萄糖等还原糖在高温或弱酸性等条件下脱水产生的具有呋喃环结构的醛类化合物,5-羟甲基糠醛过量对人体有一定的损害,其不良反应多表现为过敏性休克及呼吸系统损伤,并有一定的肾毒性。羟乙基淀粉130/0.4属于多糖类化合物,工艺过程中可能产生一定的还原糖,在高温或弱酸性等条件下脱水产生5-HMF[3]。为保证产品质量及临床用药安全,需对配制温度、不同pH值条件及灭菌工艺参数进行筛选并加以控制,尽可能降低产品中5-HMF的含量。开发了紫外分光光度法测定羟乙基淀粉 130/0.4 氯化钠注射液中5-HMF的含量,并对工艺参数进行考察,为该品种的开发提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

仪器:UV-2600 紫外分光光度计(岛津);S210-K 酸度计(METTLER TOLEDO);SQ510C 立式高压蒸汽灭菌锅(重庆雅马拓);HWS26电热恒温水浴锅(上海一恒)。

试药:羟乙基淀粉130/0.4(武汉华科大生命科技有限公司,批号:CA032020001);氯化钠(江苏省勤奋药业有限公司,批号:20201020);盐酸(南京化学试剂股份有限公司,批号:200510027A);氢氧化钠(湖南尔康制药股份有限公司,批号:100920180611);5-HMF(中检院,批号:111626-202013);羟乙基淀粉130/0.4氯化钠注射液(商品名:万汶®,北京费森尤斯卡比医药有限公司,批号81PH714)。

1.2 方法

羟乙基淀粉130/0.4氯化钠溶液配制:取约800 mL纯化水,加入18 g氯化钠、120 g羟乙基淀粉130/0.4,搅拌,溶解至澄清。补加注射用水至2 L,用0.1 mol/L盐酸或0.1 mol/L氢氧化钠调节pH值,搅拌均匀,即得羟乙基淀粉130/0.4氯化钠溶液。

1.2.1 不同配制温度考察

取上述溶液500 mL,分成4份,每份灌装于100 mL具塞玻璃瓶中,放置于不同温度条件50±2,60±2,70±2,80±2 ℃的恒温水浴锅中保温24 h,于0,4,8,24 h检查5-羟甲基糠醛的含量和pH值。

1.2.2 不同pH值考察

取上述溶液600 mL,分成5份,用0.1 mol/L盐酸或0.1 mol/L氢氧化钠调节不同pH值3.5,4.0,4.5,5.0,5.5,6.0,溶液灌封于具塞玻璃瓶中121 ℃/15 min条件灭菌,灭菌后样品放置高温条件下(60±2)℃ 30 d,于灭菌后和高温30 d取样检查不同pH值溶液的5-羟甲基糠醛的含量和pH值。

1.2.3 不同灭菌条件考察

取上述溶液500 mL,用0.1 mol/L盐酸调节pH值至4.5～5.5,于不同灭菌条件(115 ℃/31 min、121 ℃/8 min、121 ℃/15 min和121 ℃/30 min)下进行灭菌,灭菌后样品放置高温条件下(60±2)℃ 30 d,于灭菌后和高温30 d取样检查溶液的5-羟甲基糠醛的含量和pH值。精密量取上述样品溶液4 mL,置10 mL量瓶中,加水稀释至刻度,摇匀,作为供试品溶液(含羟乙基淀粉130/0.4 24 mg/mL),在284 nm的波长处测定吸光度。

1.3 5-羟甲基糠醛检测

参考《中国药典》2020年版二部中收载的葡萄糖注射液的质量标准中关于5-羟甲基糠醛检查规定,10 mg/mL的葡萄糖溶液,在284 nm波长处测定吸光度不得大于0.32[4-5]。因此取5-羟甲基糠醛对照品,加水稀释成质量浓度为2.56 μg/mL的对照品溶液,于284 nm处测定吸光度为0.312,小于0.32。因此当样品浓度为10 mg/mL时,5-羟甲基糠醛的限度质量浓度定为2.5 μg/mL,即限度为0.025%(以葡萄糖计)。参考葡萄糖注射液5-羟甲基糠醛检测方法,当羟乙基淀粉130/0.4质量浓度为24 mg/mL时,严控5-羟甲基糠醛的限度质量浓度为2.5 μg/mL,即限度为0.01%(以羟乙基淀粉130/0.4计)。

1.3.1 线性和范围

取5-羟甲基糠醛对照品适量,精密称定,加水溶解并定量稀释制成每1 mL约含5-羟基糠醛60 μg的溶液作为对照品贮备液。精密量取对照品贮备液适量,加水稀释制成质量浓度约为0.25,1.25,2.0,2.5,3.75,5.0 μg/mL的线性溶液。照紫外-可见分光光度法(中国药典2020年版四部通则0401),在284 nm的波长处测定吸光度。以质量浓度(μ/mL)为横坐标,吸光度为纵坐标,线性回归方程为Y=0.122X-0.000 2,相关系数r=0.999 7,结果表明5-羟甲基糠醛在质量浓度为0.251～5.130 μg/mL(相当于限度10%～200%)范围内与吸光度呈良好的线性关系。

1.3.2 专属性

根据处方,称取氯化钠4.5 g,置于500 mL量瓶中,加水溶解并稀释至刻度,作为空白溶液。照紫外-可见分光光度法,在284 nm的波长处测定,吸光度为0.001 6,干扰小于2%,表明空白溶液对本品5-羟甲基糠醛测定无干扰,方法专属性良好。

1.3.3 准确度

精密量取对照品贮备液(质量浓度约为0.06 mg/mL)1,2,3 mL各3份,分别置50 mL量瓶中,加空白溶液稀释至刻度,摇匀,作为回收率供试品溶液。取回收率供试品溶液适量,在284 nm的波长处测定吸光度。以“线性和范围”项下的线性回归方程计算测定量,结果见表1。

表1 5-羟甲基糠醛测定回收率试验结果(n=9)

结果表明,在相当于限度浓度的50%～150%范围内,回收率在98.6%～100.0%之间,平均回收率为99.3%,RSD=0.48%(n=9),表明方法的准确度良好。

1.3.4 检测限(LOD)和定量限(LOQ)

取5-羟甲基糠醛对照品适量,加水制成含5-羟甲基糠醛约为2.4 μg/mL的溶液作为对照品溶液。取该溶液适量,加水逐级稀释,当吸光度约为空白溶液的10倍时的浓度为定量限浓度,当吸光度约为空白溶液的3倍时的浓度为检测限浓度。结果:检测限LOD=0.039 μg/mL(占限度浓度(2.5 μg/mL)1.6%),定量限LOQ=0.129 μg/mL(占限度浓度(2.5 μg/mL)5.2%),定量限浓度、检测限浓度均小于限度浓度的10.0%,表明方法的灵敏度能够满足检测要求。

1.3.5 溶液稳定性试验

取“1.2.2”项下制备的溶液,室温放置不同时间(0,2,4,8,12 h)后测定吸光度,结果为0.123 0～0.140 2,RSD为5.4%,表明室温12 h内溶液稳定性良好。

1.3.6 精密度

1.3.6.1 重复性

取“1.2.2”项下制备的供试品溶液,在284 nm的波长处平行测定6份样品吸光度为0.120 3～0.135 8,RSD为4.3%,表明该方法重复性良好。

1.3.6.2 中间精密度

不同人员于不同时间取“1.2.2”项下制备的供试品溶液,在284 nm的波长处连续测定6份样品吸光度,A人员测定结果为0.120 3～0.135 8,B人员测定结果为0.120 3～0.142 0,12份样品吸光度RSD为5.3%,表明中间精密度良好。

2 结果

2.1 不同配制温度考察

溶液的pH值、供试品溶液(含羟乙基淀粉130/0.4质量浓度24 mg/mL)在284 nm波长处的吸光度及5-HMF含量测定结果见表2。

表2 不同温度条件下5-HMF考察结果

2.2 不同pH值考察

溶液的pH值、供试品溶液(含羟乙基淀粉130/0.4 24 mg/mL)在284 nm波长处的吸光度及5-HMF含量测定结果见表3。

表3 不同pH值条件下5-HMF考察结果(放置条件:高温(60±2)℃)

2.3 不同灭菌条件考察

溶液的pH值、供试品溶液(含羟乙基淀粉130/0.4质量浓度24 mg/mL)在284 nm波长处的吸光度及5-HMF含量测定结果见表4。

表4 不同灭菌条件下5-HMF考察结果(放置条件:高温(60±2)℃)

2.4 万汶®检测结果

精密量取万汶®10 mL,置25 mL量瓶中,加水稀释至刻度,摇匀,作为供试品溶液(含羟乙基淀粉130/0.4质量浓度24 mg/mL),在284 nm的波长处测定吸光度,结果见表5。

表5 万汶®考察结果(放置条件:高温(60±2)℃)

3 讨论

配液温度在50～80 ℃,溶液存放24 h内pH值和5-羟甲基糠醛的含量无明显变化,且均满足限度要求;溶液pH值在3.5～6.0范围内,pH值≥5.5时,灭菌后pH值出现明显下降,所有样品5-羟甲基糠醛的含量较灭菌前(与不同温度溶液结果比较)均有所增加,但均满足限度要求,各样品在高温条件放置30 d,5-羟甲基糠醛的含量均有所增加,不同pH值样品之间不存在明显差异;不同灭菌条件样品,pH值和5-羟甲基糠醛的含量无明显差异,样品高温条件下放置过程中pH值有一定的下降,5-羟甲基糠醛的含量有所增加,但均在限度范围内。灭菌后样品与万汶®比较,pH值和5-羟甲基糠醛的量无明显区别。为确保最终产品pH值和5-HMF的含量满足要求,同时保证本品无菌水平,本品生产过程注意控制溶液pH值,同时选择合适的灭菌条件。

建立了紫外分光光度法测定羟乙基淀粉130/0.4氯化钠注射液中5-羟甲基糠醛的含量,该方法操作简便,准确可靠,为该品种的质量控制提供参考,有利于加快产品开发上市。