曾 泽,张华琦,*,桂干北,圣 平

(1.铜仁职业技术学院 国家民委中兽药重点开放实验室,贵州 铜仁 554300;2.江西省科学院 生物资源研究所,江西 南昌 330096)

近100多年以来,由于温室气体的排放,导致全球气候变暖。全球气候变暖不仅是人类面临的最严峻的全球环境问题,也是制约社会经济发展乃至人类生存的重要问题。而甲烷是主要的温室气体之一,其温室效应是二氧化碳的25倍[1]。全球50%～60%的甲烷排放来自于农业生产,而其中绝大部分甲烷气体来源于反刍动物生产。反刍动物在瘤胃发酵过程中会产生大量甲烷,有2%～15%的饲料能以甲烷的形式被损失掉[2-3]。所以,反刍动物瘤胃发酵所产生的甲烷,不但造成饲料能量损失,还会造成温室效应。因此,抑制瘤胃甲烷的产生对提高饲料能量利用率和减轻温室效应具有重要作用。

近年来,抗生素类添加剂的应用受到各国政策法规的限制,寻求抗生素的替代品成为了国内外学者越来越关注的研究方向[4]。中草药提取物被认为是替代抗生素降低瘤胃甲烷排放的可行办法,相比其它添加剂,中草药提取物还具有无毒、无耐药性以及无残留等特点,可以确保动物产品的安全性[5]。但目前可以作为饲料添加剂用于降低瘤胃甲烷生成的中草药提取物并不是很多。博落回是罂粟科博落回属植物,含有血根碱、白屈菜红碱、原阿片碱等生物碱,具有杀菌、杀虫、消炎、抗病毒和抗肿瘤等作用,且不易产生耐药性,是较为理想的抗生素替代药[6-7]。研究表明,博落回提取物可作为猪、牛、家禽和鱼等畜禽的饲料添加剂,不但能预防治疗畜禽呼吸系统、消化系统疾病,还能促进畜禽的生长[8-11]。博落回提取物在湖羊瘤胃体外发酵试验中能够降低甲烷生成,瘤胃的发酵模式由乙酸型向丙酸型转变[12],但是对瘤胃微生物区系的影响没有作进一步研究。本研究利用体外瘤胃发酵技术,通过研究和分析博落回提取物对肉牛瘤胃体外发酵中甲烷产量、氨态氮(NH3-N)、挥发性脂肪酸(VFA)等发酵参数以及瘤胃微生物区系的影响,为开发安全、稳定和多功能的降甲烷调控剂提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本试验所用的博落回提取物为固体粉末,购买于湖南美可达生物资源有限公司,其中血根碱含量40%,白屈菜红碱含量20%。

1.2 试验动物及饲养管理

选取3只体况良好,体重(250±15)kg,安装有永久性瘤胃瘘管的锦江黄牛作为瘤胃液供体动物。肉牛饲喂该场全混和日粮(主要成分为黑麦草、玉米、麦麸、豆粕等,精粗比为60∶40),每日09:00和17:00 2次等量饲喂,试验前驱虫,自由饮水、采食。

1.3 人工瘤胃液的配制

晨饲前抽取3头瘘管肉牛的瘤胃液混合均匀,置于预热过的保温杯中密封带回实验室,在39 ℃水浴环境中经四层纱布过滤备用。人工唾液配置参考Menke等[13]的方法,持续通入CO2,直至溶液颜色变为无色。以1∶2的比例充分混匀过滤后的瘤胃液和人工唾液作为人工瘤胃液,将人工瘤胃液置于39 ℃水浴锅中,持续通入CO2以保持厌氧环境待用。

1.4 体外发酵底物

底物经65 ℃烘干48 h,充分研磨过1 mm筛,发酵底物精料和黑麦草按精粗比为50∶50组成。发酵底物组成及营养水平见表1。

表1 发酵底物组成及营养水平(干物质基础)Table 1 Composition and nutrient levels of fermentation substrate (DM basis)

1.5 试验设计

准确称取500 mg的发酵底物置于150 mL产气瓶中。试验采用完全随机试验设计,分为对照组(不添加博落回提取物)和试验组(按0.11%底物干物质基础添加博落回提取物)。在产气瓶中迅速加入预热的人工瘤胃液60 mL,向瓶中通入CO25 s后,立即盖上瓶塞,将产气瓶放置于恒温摇床中,100 r/min 39 ℃培养12 h和24 h。每个处理组设置5个重复,试验重复3次,同时设置空白对照组(不添加发酵底物和博落回提取物,只添加人工瘤胃液)。

1.6 样品采集和测定分析

1.6.1 发酵液样品采集与处理 分别于发酵3 h、6 h、9 h、12 h和24 h时测定产气量,然后采集气体样本用于甲烷测定。分别于培养12 h和24 h后将产气瓶取出放入冰水浴中终止发酵,将产气瓶中的发酵液取出,放入已知质量的50 mL塑料离心管中,立即用pH计测定发酵液的pH。取2 mL发酵液用于微生物区系测定。将发酵液5000×g离心10 min,取上清液用于NH3-N、微生物蛋白(MCP)和VFA的测定,离心之后的固相残渣用于干物质降解率的测定。

1.6.2 产气量测定 参照Romero-Pérez等[14]的方法,用压力传感器测定产气瓶内的压力值,结合产气瓶容积换算出产气瓶中的实际产气量。产气量计算公式如下:

GP为产气瓶的实际产气量(mL); P为实际测出的压力值(kpa);V1为产气瓶的容积(mL);V2为加入发酵液的容积(mL);W为底物干物质质量(g)。

1.6.3 甲烷产量测定 参考Menke等[13]的气相色谱法条件测定甲烷含量。色谱条件:载气为高纯氮气,燃气为高纯氢气,空气为助燃气,柱温70 ℃,前进样口温度50 ℃,后进样口温度375 ℃,FID检测器温度200 ℃,空气流速360 mL/min,氢气流速45 mL/min,氮气流速25 mL/min。

1.6.4 NH3-N浓度测定 发酵液中NH3-N浓度采用冯宗慈等[15]改进的比色法进行测定。采用标准系列溶液制作标准曲线,得到回归方程式,再用酶标仪检测待测样本700 nm吸光值,即可根据回归方程式计算样品中的NH3-N浓度。

1.6.5 MCP浓度测定 发酵液中MCP浓度采用杨德莲等[16]的方法进行测定。取经离心预处理去除原虫和饲料大颗粒的上清液1 mL,16000×g离心20 min,弃去上清液,沉淀的细菌部分加0.9 mL的10%三氯乙酸溶液,混匀,4000 r/min离心10 min,取沉淀物加5%氢氧化钠溶解,然后稀释至2.5 mL。4000 r/min离心10 min,用紫外分光光度计测定上清液280 nm和260 nm吸光值。应用下面公式即可计算细菌蛋白含量。蛋白质含量(mg/mL)=(1.45×D280 nm-0.74×D260 nm)。

1.6.6 VFA含量测定 发酵液中VFA含量采用王加启[17]的方法用气相色谱进行测定。取发酵液1 mL于1.5 mL离心管中,4 ℃ 13000×g离心10 min。上清液转移至加有20 μL 85%正磷酸的1.5 mL离心管中,充分混匀,4 ℃ 13000×g离心10 min。上清液过0.22 μm水系滤膜,打入气相上样瓶自动进样至气相色谱仪的火焰离子化检测器进样口进行测定。

1.6.7 微生物区系测定 发酵液中微生物相对丰度采用Illumina NovaSeq 测序进行分析。提取样本DNA,分别采用细菌16S rDNA扩增引物进行PCR扩增,对PCR扩增产物进行纯化,构建文库,Illumina NovaSeq 测序,对测序得到的下机数据进行拼接和质控,进行嵌合体过滤,得到有效数据并进行分析。

1.7 统计分析

采用Excel 2016进行数据的初步统计处理,使用SPSS 16.0软件对数据进行独立样本T检验分析,并以P<0.05为差异显著性判断的标准。

2 结果与分析

2.1 对瘤胃体外发酵产气量和甲烷产量的影响

由表2可知,发酵3 h、6 h、9 h和12 h时,博落回提取物添加组的产气量显著低于对照组(P<0.05);发酵24 h时,相比对照组,博落回提取物添加组的产气量有下降的趋势,但无差异显著性(P>0.05)。发酵3 h、6 h、9 h和12 h时,博落回提取物添加组的甲烷产量显著低于对照组(P<0.05);发酵24 h时,博落回提取物添加组的甲烷产量显著高于对照组(P<0.05)。

表2 博落回提取物对瘤胃体外发酵产气量和甲烷产量的影响Table 2 Effects of M. cordata extract on gas and methane emission in rumen fermentation in vitro

2.2 对pH、NH3-N、MCP、干物质降解率、中性洗涤纤维和酸性性洗涤纤维的影响

由表3可知,发酵12 h和24 h时,相比对照组,博落回提取物添加组的pH、干物质降解率、中性洗涤纤维和酸性性洗涤纤维无明显变化(P>0.05)。发酵12 h和24 h时,博落回提取物添加组发酵液中NH3-N浓度显著低于对照组(P<0.05)。发酵12 h时,博落回提取物添加组发酵液中MCP浓度显著低于对照组(P<0.05),但发酵24 h时,相比对照组,博落回提取物添加组发酵液中MCP浓度无明显变化(P>0.05)。

表3 博落回提取物对发酵液pH及干物质降解率、NH3-N、MCP、中性洗涤纤维和酸性性洗涤纤维含量的影响Table 3 Effects of M. cordata extract on pH, dry matter degradation rate, NH3-N, MCP,Neutral detergent fiber, and acidic detergent fiber content of fermentation fluid

2.3 对VFA的影响

由表4可知,发酵12 h时,相比对照组,博落回提取物添加组的丁酸含量和乙酸/丙酸比值无明显变化(P>0.05),但总挥发性脂肪酸(TVFA)、乙酸和丙酸含量显著降低(P<0.05)。发酵24 h时,相比对照组,博落回提取物添加组的TVFA、乙酸、丙酸、丁酸含量和乙酸/丙酸比值均无明显变化(P>0.05)。相对发酵12 h时,对照组和博落回提取物添加组发酵24 h时TVFA、乙酸、丙酸、丁酸含量和乙酸/丙酸比值均升高。

表4 博落回提取物对发酵液VFA浓度的影响Table 4 Effects of M. cordata extract on VFA concentration of fermentation fluid

2.4 对瘤胃微生物区系的影响

由表5可知,对照组和博落回提取物处理组的瘤胃发酵液中,厚壁菌门和拟杆菌门占主导地位。与对照组相比,发酵12 h后,博落回提取物处理组的拟杆菌门相对丰度显著升高(P<0.05),疣微菌门相对丰度在数值上略有升高,但无差异显著性(P>0.05),黏胶球形菌门相对丰度显著降低(P<0.05),厚壁菌门、软壁菌门、变形杆菌门、Kiritimatiellaeota、浮霉菌门和放线菌门相对丰度在数值上略有降低,但无差异显著性(P>0.05);发酵24 h后,博落回提取物处理组的厚壁菌门、疣微菌门、浮霉菌门和放线菌门相对丰度在数值上略有升高,但无差异显著性(P>0.05),拟杆菌门、软壁菌门、变形杆菌门、Kiritimatiellaeota和黏胶球形菌门相对丰度在数值上略有降低,但无差异显著性(P>0.05)。

由表6可知,对照组和博落回提取物处理组的瘤胃发酵液中假丁酸弧菌属、毛螺菌属、琥珀酸菌属和疣微菌属占主导地位。发酵12 h后,与对照组相比,博落回提取物处理组的毛螺菌属和支原体属相对丰度显著降低(P<0.05),假丁酸弧菌属、琥珀酸菌属和甲烷细菌属相对丰度在数值上略有降低,但无差异显著性(P>0.05),疣微菌属相对丰度在数值上略有升高,但无差异显著性(P>0.05);发酵24 h后,与对照组相比,博落回提取物处理组的假丁酸弧菌属、毛螺菌属、疣微菌属和甲烷细菌属相对丰度在数值上略有升高,但无差异显著性(P>0.05),琥珀酸菌属和支原体属相对丰度在数值上略有降低,但无差异显著性(P>0.05)。

3 讨 论

3.1 对体外瘤胃发酵产气量和甲烷产量的影响

反刍动物瘤胃内含有丰富的瘤胃微生物,瘤胃微生物在发酵饲料的过程中会产生大量的气体。在瘤胃体外发酵试验中,产气量能够反映发酵底物的可发酵程度和瘤胃微生物的活动趋势,即可作为瘤胃体外发酵试验中评定瘤胃微生物发酵和发酵底物可利用性的指标之一[18]。在瘤胃体外发酵中,产气量与日粮中有机物的消化率呈正相关[13]。研究表明,富含生物碱的提取物可以作为一种潜在的饲料添加剂以降低瘤胃发酵的产气量[19]。在本研究中,添加博落回提取物之后,发酵3 h、6 h、9 h和12 h时的产气量均显著低于对照组,但发酵24 h时,产气量无差异显著性变化,这表明博落回提取物对瘤胃微生物发酵有一定抑制作用,但随着时间的延长,抑制作用会慢慢消失。之前研究结果表明,在湖羊瘤胃体外发酵研究中,博落回提取物能够降低产气量[12],与本研究的实验结果一致。

反刍动物瘤胃在发酵的过程中会产生大量甲烷气体,这不但会浪费饲粮能,还会加速全球温室效应,因此降低瘤胃发酵甲烷的排放对减少饲料能的浪费和减少环境污染均有重要作用。研究表明,富含生物碱的提取物可以减少瘤胃发酵甲烷的产量[6,20-21]。在湖羊瘤胃体外发酵研究中,博落回提取物能够显著降低甲烷的产量[12]。在本研究中,添加博落回提取物发酵3 h、6 h、9 h和12 h后,甲烷产量均显著降低,但是发酵24 h后,甲烷产量却增加了,这可能是由于博落回提取物对产甲烷菌的抑制作用在12 h后缓慢消失,产甲烷菌迅速增长,这才导致24 h时甲烷产量增加;微生物测序结果表明,发酵12 h后产甲烷菌相对丰度有降低的趋势,发酵24 h后产甲烷菌相对丰度有升高的趋势,但均无差异显著性。本研究中博落回提取物的添加能够降低瘤胃发酵12 h后发酵液中乙酸和丙酸浓度,这也可能是发酵12 h后甲烷产量减少的原因之一,因为乙酸和丙酸是瘤胃发酵过程中生成甲烷的底物[22]。

3.2 对体外瘤胃发酵NH3-N和MCP的影响

NH3-N是瘤胃发酵和消化代谢过程中的重要产物,同时也是大多数瘤胃微生物合成MCP的原料,NH3-N浓度可以直接反映瘤胃发酵环境的好坏[23]。在本研究中,添加博落回提取物之后可以显著降低NH3-N的浓度,这与之前的研究结果一致[12],可能是由于博落回提取物降低了一些微生物利用碳水化合物的能力,所以导致NH3-N的浓度降低。MCP是瘤胃发酵的重要指标,能够反应瘤胃内细菌、原虫、真菌等微生物的数量[24]。在本研究中,添加博落回提取物可以降低发酵12 h时的MCP浓度,但是发酵24 h时的MCP浓度没有明显变化,这可能是由于合成MCP的原料NH3-N减少了,所以会导致发酵液中MCP含量降低,另外可能由于博落回提取物对瘤胃微生物有抑制作用,降低了微生物的繁殖速度,微生物数量减少,这才导致发酵12 h时MCP含量降低。但是,随着时间的延长,博落回提取物对瘤胃微生物的抑制作用逐渐消失,瘤胃微生物数量逐渐增加,导致发酵24 h时MCP含量与对照组无明显变化。

3.3 对体外瘤胃发酵VFA的影响

VFA是瘤胃微生物发酵碳水化合物的主要产物,其中以乙酸、丙酸和丁酸为主,约占TVFA的95%。VFA是反刍动物的主要能量来源,其含量和组成直接反映瘤胃新陈代谢活动的水平[25-26]。在本研究中,添加博落回提取物能够降低总挥发性脂肪酸、乙酸和丙酸浓度,这与之前研究结果不一致[12],这可能是由于博落回提取物的添加剂量不一样所致,也有可能是由于瘤胃液供体动物不一样所致。本试验中随着时间的延长,VFA的浓度逐渐升高,这主要是因为体外发酵是在密闭的发酵瓶中进行的,没有VFA的消耗和排出过程。本研究结果表明,添加博落回提取物对发酵液的pH没有显著的影响,pH保持在正常的pH范围内(6.37～7.35),这对纤维素消化、蛋白质合成、蛋白水解活动、挥发性脂肪酸合成以及瘤胃微生物活动无不良影响[27-28]。在本研究中,添加博落回提取物对干物质降解率没有明显影响,这表明该浓度的博落回提取物不影响日粮的发酵和降解。

3.4 对体外瘤胃发酵微生物区系的影响

反刍动物瘤胃内含有数量和种类都较为丰富的微生物,瘤胃发酵的过程其实就是瘤胃微生物对饲料中纤维素和半纤维素等植物物质进行消化的过程,瘤胃微生物通过发酵能够将饲料转化为反刍动物能够利用的营养物质,瘤胃微生物的种类和相互之间的比例能够直接影响反刍动物对饲料中营养物质的消化利用[16,29-30]。在本研究中,添加博落回提取物能够显著升高拟杆菌门的相对丰度,显著降低黏胶球形菌门、毛螺菌属和支原体属的相对丰度。添加博落回提取物发酵12 h之后,细菌的优势菌群由厚壁菌门改变为拟杆菌门,且大部分细菌的相对丰度均有不同程度的降低;添加博落回提取物发酵12 h之后有降低甲烷细菌属相对丰度的趋势,但发酵24 h之后甲烷细菌属相对丰度略有升高,这与本研究中甲烷产量先降低后升高的结果一致。同种微生物在发酵12 h和24 h时的相对丰度有一定差异,随着时间的延长,博落回提取物对厚壁菌门、毛螺菌属和甲烷细菌属等微生物的抑制作用会消失,这表明博落回提取物对瘤胃微生物相对丰度的影响有时效性。

4 结 论

在本研究中,添加0.11%博落回提取物可降低产气量,甲烷产量先降低后升高,可降低发酵液中TVFA、乙酸、丙酸、NH3-N和MCP浓度,可显著升高拟杆菌门相对丰度,显著降低黏胶球形菌门、毛螺菌属和支原体属的相对丰度,但对干物质降解率无显著影响,表明博落回提取物对体外瘤胃发酵有一定的调控作用。但还需进一步评估博落回提取物对反刍动物体内瘤胃发酵的影响。