罗 倩 罗明凯 向 准

（1贵州师范学院，贵州贵阳 550018；2贵州省生物研究所，贵州贵阳 550009）

羊肚菌（Morchellaspp.）是一种珍稀的食用菌，因菌盖表面状如羊肚、凹凸不平而得名，味道鲜美，营养价值高[1-2]。近年来，随着羊肚菌人工栽培面积的扩大，市场上出现了菌种质量参差不齐、管理混乱甚至同种异名的现象，增加了产业风险。目前，亟须寻找快速检测指标，以鉴别良莠不齐的菌种。同工酶是一类具有相同催化反应功能但分子结构及理化性质不同的酶，早在20 世纪80 年代，同工酶电泳技术已在多种食用菌的菌种选育、分类鉴定、多样性遗传分析及代谢水平差异等方面得到了广泛应用[3]，如灵芝[4]、平菇[5]、木耳[6]、灰树花[7]、金针菇[8]、牛肝菌等[9]。在食用菌研究中，应用较多的同工酶是酯酶同工酶和过氧化物同工酶，但同工酶电泳结果的准确性和重复性会受到食用菌培养方式、凝胶浓度、电泳条件的影响。为此，我国于2006 年发布了中华人民共和国农业行业标准《食用菌菌种真实性鉴定酯酶同工酶电泳法》（NY/T 1097—2006），标准中规定了样品制备、电泳试剂配方、凝胶浓度，使操作更规范化，保证了结果的可重复性，但标准中适用的食用菌种类较少，集中在侧耳类、茶树菇、杏鲍菇、香菇、双孢蘑菇。目前，关于羊肚菌同工酶电泳的报道较少，为此，本研究从凝胶浓度、染色条件及培养时间等方面优化羊肚菌同工酶电泳条件，以期为羊肚菌菌种资源鉴定及品种选育提供支撑。

1 材料与方法

1.1 试验菌种

羊肚菌GY-05，保存于贵州师范学院菌种室。

1.2 试验试剂配制

采用垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳进行过氧化物酶同工酶电泳和酯酶同工酶[10-12]分析（见表1、表2）。

表2 酯酶同工酶电泳试剂配制

1.3 试验方法

1.3.1酶液的提取取培养7 d 羊肚菌菌丝体0.50 g，加1 mL样品提取液和0.50 g石英砂，用冰浴研磨后将样品在4 ℃、12 000 r/min 下离心20 min，取其上清液备用。

1.3.2制胶板厚度选择不同制胶板厚度0.75、1.00、1.50 mm，分离胶7%，浓缩胶5%，电泳观察结果。

1.3.3凝胶浓度参照文献方法制备浓缩胶和分离胶，其中分离胶的浓度分别为7%、9%和12%。采用80 V 稳压电泳，溴酚蓝指示剂进入分离凝胶后，将电压调为120 V，溴酚蓝指示带离底部1 cm 时停止电泳，染色后，观察记录结果。不同浓度分离胶配方见表3[3，10]。

表3 不同浓度分离胶配方

1.3.4培养时间将羊肚菌GY-06 置于22 ℃暗培养不同天数（4、6、8、10、12、15、17 d），按照优化条件进行酯酶同工酶电泳。

2 结果与分析

2.1 酯酶同工酶电泳条件优化

2.1.1制胶板厚度对羊肚菌酯酶同工酶电泳的影响试验选择7.00%的分离胶浓度，研究不同制胶板厚度（0.75、1.00、1.50 mm）对羊肚菌酯酶同工酶电泳的影响。当分离胶浓度为7%时，3种厚度的制胶1.3 板的电泳效果都不太好，染色酶带较少，酶带不清晰，但考虑上样量的因素，选择1.50 mm厚度的制胶板用于后续试验。

2.1.2分离胶浓度对羊肚菌酯酶同工酶电泳的影响结合国标和文献，选择7%、9%和12%的分离胶浓度进行羊肚菌酯酶同工酶电泳，结果见表4。由表4可知，分离胶浓度为12%时，羊肚菌酯酶同工酶酶带清晰可辨，分离效果较好。

表4 分离胶浓度对羊肚菌酯酶同工酶电泳的影响

2.2 培养时间对酯酶同工酶电泳结果的影响

从图1 和图2 可知，羊肚菌GY-05 的培养时间会影响酯酶种类和数量的表达。每个泳道可分辨的酶带为2～6条，7个时间处理总共有34条酶带，Rf值为0.02～0.52，2 条共同酶带的迁移率为0.06、0.16。培养4～6 d 的酯酶谱带数量较少，随着培养时间的增加，谱带数量增加；培养10 d后，酯酶谱型基本保持不变，表达量上略有差异。综合考虑时间成本和电泳效果，选择最优培养时间为10 d。

图1 菌株GY-05第21代酯酶同工酶酶谱

图2 菌株GY-05酯酶同工酶谱模式

2.3 羊肚菌过氧化物同工酶染色条件优化

为了获得清晰的羊肚菌过氧化物同工酶酶谱，试验考虑了凝胶浓度、供氢体和底物浓度等因素，比对了5种染色方法的效果，其结果如表5、图3所示。由表5、图3可知，分离胶浓度为12%，方法二染色时能得到清晰酶谱（图3），谱带数量为3～4条，其余方法均无法达到分析要求。羊肚菌过氧化物同工酶最适的染色液配方为5 mL 醋酸联苯胺溶液，2 mL 3%H2O2，93 mL H2O。

图3 过氧化物同工酶酶谱（方法二染色）

表5 羊肚菌GY-05过氧化物同工酶电泳染色结果

3 讨论与结论

同工酶技术作为一项可靠的分子标记技术，具有快速、直观、灵敏、简单、遗传稳定、不易受外界环境影响、酶谱类型丰富等特点[13]，是从基因产物水平来研究生物的遗传变异，从蛋白质水平上研究生物群体遗传分化的重要手段之一，它弥补了以菌落形态、颜色、孢子形态、子实体形态等特征分类的传统方法的不足，可应用于菌种选育、分类鉴定[14]。根据食用菌种类的不同，电泳条件特别是凝胶浓度也随之发生变化，茶树菇[15]和香菇[16]的分离胶浓度为7%，双孢蘑菇的分离胶浓度为9%[17]。《食用菌菌种真实性鉴定酯酶同工酶电泳法》中尚无关于羊肚菌电泳的相关标准，这为酯酶同工酶电泳法在羊肚菌研究中的利用带来了不便。本试验从凝胶浓度、培养时间、试剂配方、染色条件等方面探索了羊肚菌酯酶同工酶电泳的最佳条件，即1.5 mm 胶板、12%浓度分离胶、5%浓缩胶，样品培养时间为10 d。任桂梅等[18]在研究羊肚菌不同生长期酯酶同工酶采用的分离胶浓度为10%，这可能因为子实体部分的酶种类和分子量不同，但羊肚菌酯酶同工酶电泳分离胶浓度与国标中大多数食用菌分离胶浓度7%有差异。本研究发现，同一菌株在不同培养时间酯酶同工酶的种类和表达数量有差异，在杏鲍菇的相关研究中也出现类似结果[19]，这可能是由翻译后基因产物的修饰或基因位点变化所引起的。综上，利用同工酶进行食用菌菌种选育和鉴定时，除固定电泳条件外，还应固定最佳的培养时间，才能保证结果的稳定性和准确性。

过氧化物酶是广泛存在于各种动物、植物和微生物的一类氧化酶，以过氧化氢为电子受体催化底物氧化的酶，其供氢体较多[20]。过氧化物同工酶的电泳分析中，影响酶带清晰度的因素除凝胶质量外，染色液的配比也很关键。本研究发现，过氧化氢用量会影响过氧化物同工酶酶带颜色的深浅，当电泳条件相同时，含3% H2O2的染色液的呈色效果优于30% H2O2染色液，这与陈红兵等[21]的研究结果相一致，这可能是底物抑制现象，纳摩尔水平的过氧化氢可导致血卟啉中间体的降解[22]。本试验电泳得到的过氧化物酶酶带条带较少，这可能与羊肚菌分解利用木质素的能力较弱，淀粉酶活力较高相关[23]，因此，不建议过氧化物酶同工酶作为羊肚菌检测遗传多样性的生化标记。