陆有飞 黄庆南 李凤梅 莫宏志 黄睿思 覃彬茜 陈超燕 谢江*

（1. 广西农业职业技术大学，南宁 530007；2. 广西丽诚东生物股份有限公司，南宁 530105；3. 平南县上渡街道农业综合服务中心，广西 贵港 537300）

禽流感（AI）是威胁人类和禽类健康的一种重要疾病，我国现将其列为重大动物疫病，采取强制免疫进行防控。目前国内外生产的禽流感疫苗多为以矿物油为佐剂的灭活疫苗，其优点是价格便宜，疫苗免疫抗体效价高，免疫期持续期长；缺点是接种后不易吸收代谢，动物组织中残留的苯环结构，进入食物链会威胁人类健康［1-2］。不同来源的矿物油质量各异，其免疫增强作用和安全性风险也存在差异［3-5］，寻找无副作用、无残留、免疫效果好的新型佐剂一直是疫苗的研究方向。

火麻是一种药食同源的桑科植物，世界各地普遍种植。火麻油又称火麻仁油，为火麻果仁压榨出的一种可食用的植物油。世界长寿之乡广西巴马县盛产火麻油。火麻油富含油酸、亚油酸和α-亚麻酸等多种不饱和脂肪酸，具有降血脂、抗疲劳、抗炎、抗氧化和抗肿瘤作用［6-9］，在食品、化妆品、保健品和药品生产中得到广泛应用［10-12］，在动物营养方面的应用证实具有促进生长和脂质代谢、提高免疫力和抗氧化能力［13-14］，但是在兽医生物制品方面的应用尚未见报道。为寻找安全、无毒、无残留的新型灭活疫苗佐剂，本研究使用火麻油代替矿物油作为疫苗佐剂，开展禽流感火麻油佐剂灭活疫苗实验室制备乳化条件研究，以确定疫苗的实验室制备工艺规程，现将初步结果报告如下。

1 材料

1.1 疫苗毒株

禽流感H9 亚型HN03 株，由广西丽诚东生物股份有限公司提供，购自中国兽医药品监察所。

1.2 实验动物

SPF 种蛋购自淅江立华农业科技有限公司。SPF鸡由广西丽诚东生物股份有限公司提供。

1.3 主要试剂

火麻油（压榨一级）购自广西巴马千百年健康食品有限公司。吐温-80、司班-80 购自国药集团化学制剂有限公司。硫乙醇酸盐培养基（T.G）、酪胨琼脂（G.A）和葡萄糖蛋白胨汤（G.P）购自北京奥博星生物技术有限责任公司。

1.4 主要仪器和设备

高速乳化机购自青岛双峰压力容器有限公司。高速离心机购自湖南湘仪实验室仪器开发有限公司。全自动孵化机购自青岛兴仪电子设备有限责任公司。旋转粘度计购自上海昌吉地质仪器有限公司。

2 方法

2.1 禽流感火麻油佐剂灭活疫苗制备工艺

2.1.1 抗原制备

禽流感（H9 亚型，HN03 株）合格抗原批号为20221110，由广西丽诚东生物股份有限公司根据《禽流感（H9 亚型）灭活疫苗（HN03 株）生产工艺规程》［15］（以下简称《规程》）制备，经甲醛灭活。

2.1.2 油相制备

取一定量的司班-80 加入60℃的火麻油中，搅拌均匀后置116℃高压灭菌40 min，冷却至25℃备用。

2.1.3 水相制备

先将吐温-80 置116℃高压灭菌40 min 后冷却至25℃，再取一定量的吐温-80，加入禽流感灭活抗原液中，混合均匀后备用。

2.1.4 乳化方法

根据油相与水相比例设置，先将油相加入乳化缸内，以1000 r/min 边搅拌边将水相加入油相中，再以6000~12000 r/min 转速乳化5 min，即得油包水型禽流感火麻油佐剂疫苗。

2.1.5 疫苗乳化条件的优化

2.1.5.1 单因素试验 分别考察吐温-80 占比、司班-80 占比、油相与水相比例和转速对疫苗乳化效果的影响。采用固定3 个变量，变化考察变量。吐温-80 占比、司班-80 占比为其用量占乳化总量的体积百分比。

（1）吐温-80 占比 吐温占比分别为1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%，司班-80 占比为2.5%，油相与水相比例为2∶1，转速为9000 r/min，分别进行乳化。按《规程》进行稳定性检验：取疫苗10 mL 加入离心管中，以3000 r/min 离心15 min，测定水相析出的量。

（2）司班-80 占比 司班-80 占比分别为2.5%、3.0%、3.5%、4.0%、4.5%，吐温-80 占比为试验（1）中得到的较优值，油相与水相比例为2 ∶1，转速为9000 r/min，分别进行乳化，按《规程》进行稳定性检验。

（3）油相与水相比例 油相与水相比例分别为3∶1、7∶3、2∶1、3∶2、1∶1，吐温-80 占比与司班-80 占比采用试验（1）（2）中所得到的较优值，转速为9000 r/min，分别进行乳化，按《规程》进行稳定性检验。

（4）乳化转速 转速分别为6000 r/min、7000 r/

min、8000 r/min、9000 r/min、10000 r/min，吐温-80占比、司班-80 占比及油相与水相比例采用试验（1）（2）（3）中所得到的较优值，分别进行乳化，按《规程》进行稳定性检验。

2.1.5.2 正交试验 以单因素试验结果为基础，正交试验以吐温-80 占比（A）、司班-80 占比（B）、油相与水相比例（C）、乳化转速（D）4 个因素为考察对象，选择每个因素最优点及其前后各一点共3 个水平，设计L9（34）正交试验（表1）分别开展。

表1 L 9（34）正交试验设计表

2.2 疫苗试制与检验

根据方法2.1 确定禽流感火麻油佐剂灭活疫苗最优乳化条件，参照《规程》规定的抗原含量（每毫升乳剂含禽流感抗原0.24 mL），用火麻油代替矿物油制备禽流感火麻油佐剂灭活疫苗3 批，进行物理性状及无菌检验。

2.2.1 疫苗物理性状检验 取试制疫苗每批5 瓶，参照《规程》中《性状检验操作细则》进行检查。方法如下：

2.2.1.1 外观：取疫苗加入无色透明玻璃瓶，在2000 Lx 日光灯光照度下，目测疫苗颜色。

2.2.1.2 剂型：为油包水型。取一清洁吸管，吸取少量试制疫苗滴于冷水中，除第一滴外，均应不扩散。

2.2.1.3 稳定性：吸取疫苗10 mL 加入离心管中，以3000 r/min 离心15 min，取出观察乳剂管底水相析出的量，应不超过0.5 mL。

2.2.1.4 黏度：用旋转式粘度计测定，应＜200 cP。

2.2.2 疫苗的无菌检验：取试制疫苗每批5 瓶，按《规程》中《无菌/纯粹检验操作细则》进行检验。无菌取样分别接种含硫乙醇酸盐培养基（T·G），酪素胰酶琼脂（G·A）及葡萄糖蛋白胨汤（G·P）培养基中，置37℃培养96 h，观察有无细菌、霉菌生长。

结果判定：样品应5/5 无菌生长。如发现污染杂菌或结果可疑时，可抽取10 瓶样品重检，重检结果仍有杂菌，应判为不合格。

3 结果与分析

3.1 疫苗乳化条件的优化

3.1.1 单因素试验结果

通过稳定性检验以试制疫苗水相析出的量多少来评价其稳定性。结果显示，吐温-80 占比为3.0%时，疫苗水析出量最小；司班-80 占比为4.5%时，疫苗水析出量最小；油相与水相比例为7∶3 时，疫苗水析出量最小；乳化转速10000 r/min 时，疫苗水析出量最小（图1）。因此确定吐温-80 占比3.0%、司班-80 占比4.5%、油相与水相比例7∶3、乳化转速10000 r/min 为各因素最佳水平。

图1 单因素试验对水析出量的影响

3.1.2 正交试验结果

正交试验结果见表2，方差分析见表3。根据表2 极值（R）的大小可知各因素对疫苗乳化效果的影响依次为C ＞D ＞A ＞B，即油相与水相比例对疫苗乳化效果的影响最大，司班-80 占比（%）对乳化效果影响最小；由k（同一因素同一水平三个试验结果的均值，k 值越小说明析出水量越小）值可知，疫苗乳化条件最优组合为A2B3C2D2，即吐温-80 占比3.0%，司班-80 占比4.5%，油相与水相比例为7∶3，乳化转速10000 r/ min。由方差分析结果（表3）可知，各因素对疫苗乳化结果影响无显著性差异。因此选取最优组合A2B3C2D2即吐温-80 占比3.0%，司班-80 占比4.5%，油相与水相比例7∶3，转速10000 r/min 为疫苗试制最佳乳化条件。

表2 正交试验结果

3.2 疫苗试制与检验结果

根据疫苗乳化条件最优组合试制禽流感火麻油佐剂灭活疫苗3 批，按照《规程》中《性状检验操作细则》和《无菌/纯粹检验操作细则》进行检验，检验结果见表4，验证了最优组合试制的疫苗最稳定。

表4 疫苗检验结果

4 讨论

乳化条件优化试验结果表明，吐温-80 占比为3%、司班-80 占比为4.5%、油相与水相比例7∶3、乳化转速为10000 r/min 是疫苗最佳乳化条件，制备的疫苗稳定性最佳。试制的禽流感火麻油佐剂灭活疫苗为微黄白色油包水型均匀乳剂，黏度合格，无细菌、霉菌污染，经3000 r/min 离心15 min 剂型稳定。本试验结果与黄庆南等［16］的火麻油乳剂稳定性研究结果一致，经3000 r/min 离心15 min 不分层。闫馨月等［17］研究通过适当的超声处理可提高火麻油乳剂的稳定性，该方法可为疫苗乳剂制备工艺的进一步研究提供借鉴。

火麻油中必需脂肪酸的组成与比例更符合动物代谢需要，在动物营养方面的研究极具功能性开发潜力，在新型无残留的动物疫苗佐剂方面的应用探索也具有进一步研究的价值，但火麻油佐剂的质量标准及其配方的优化、疫苗免疫持续期、疫苗保存期等有待后续的深入规范研究。

5 结论

本研究首创采用火麻油代替矿物油作为佐剂，实验室研究能够制备出稳定的禽流感火麻油佐剂灭活疫苗。