左璐莹, 吴继来, 初 楚, 陈欣渝, 陈安良*,

(1.浙江农林大学 林业与生物技术学院，杭州 311300；2.浙江省杭州市临安区植物检疫站，杭州 311300)

植物抗病激活剂被称为植物疫苗，在离体条件下没有抑菌能力，但在活体条件下可表现出良好的防治效果[1]。水杨酸 (SA) 是诱导植物抗病性的信号分子，可通过诱导植物产生病程相关蛋白(PR 蛋白)、调节相关保护酶活性等途径使植物体产生系统获得性抗性 (SAR)[2]。目前利用水杨酸防治冬瓜枯萎病[3]、番木瓜环斑病[4]、草莓白粉病[5]等的效果已被证实，但其在林业中的实际应用尚未见报道。

油茶炭疽病是油茶Camellia oleifera上最重要的病害之一，可危害油茶果、叶、枝梢和花蕾等部位，引起落果、落蕾、落叶、枝梢枯死、枝干溃疡，甚至整株衰亡[6]。其病原菌主要为胶孢炭疽菌Colletotrichum gloeosporioides[7]，生产上常采用多菌灵、甲基硫菌灵等苯并咪唑类杀菌剂进行防治[8]，但单一化学农药长期使用易导致病原菌产生抗药性[9]，且大量使用杀菌剂对油茶产品质量安全也具有不利影响。将化学杀菌剂与植物抗病激活剂混合使用，可在保证防治效果的同时减少化学药剂的使用，以减轻化学药剂带来的环境压力、抗性及农产品残留污染等问题，对促进绿色防控、推进可持续农业生态发展具有重要意义[10]。

本研究团队前期室内试验发现，抗病激活剂水杨酸可诱导油茶产生抵御炭疽病的能力，其与咪鲜胺混用对抑制离体炭疽病菌还具有一定的增效作用[11]，但该结论尚未在活体和田间得到证实，目前水杨酸也还未进行单独的农药品种登记。本研究采用水杨酸原药，在油茶苗上针对炭疽病进行了咪鲜胺与水杨酸混配的防治效果试验，继而进行了田间药效试验验证，以期在减少杀菌剂咪鲜胺用量的同时，获得理想的田间防效，达到减药增效的目的，为植物抗病激活剂的实际应用和油茶炭疽病防治提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.1.1 油茶植株、菌株和药剂 油茶品种为长林53 号，来源于浙江省建德市油茶苗圃。胶孢炭疽菌C.gloeosporioides菌株由浙江农林大学生物农药高效制备技术浙江省工程实验室保存并提供。99.5%水杨酸 (salicylic acid) 原药，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；450 g/L 咪鲜胺水乳剂 (prochloraz 450 g/L EW)，青岛翰生生物科技股份有限公司。

3WBD-16 型背负式电动喷雾器，北京中保绿农科技集团。

母液配制：将750 mg 水杨酸原药加入4 mL无水乙醇中，再加入1 mL OP-10 乳化剂，混匀，配制为150 mg/mL 的水杨酸母液；将4 g 咪鲜胺EW 加入18 mL 无菌水中，配制为100 mg/mL 的咪鲜胺母液。试验时用清水稀释母液，分别配制成以下系列质量浓度药液：150 mg/L 水杨酸(SA)、100 mg/L 咪鲜胺 (P1)、200 mg/L 咪鲜胺(P2)、300 mg/L 咪鲜胺 (P3)、150 mg/L 水杨酸 +100 mg/L 咪鲜胺 (C1)、150 mg/L 水杨酸 + 200 mg/L咪鲜胺 (C2)、150 mg/L 水杨酸 + 300 mg/L 咪鲜胺(C3)，同时设清水对照 (CK)，共8 个处理。每组药剂配制1 L。

1.2 试验方法

1.2.1 油茶苗施药及叶片接菌 将供试胶孢炭疽菌菌株接种于经高温灭菌的PDA 平板上，置于25 ℃、黑暗条件下培养5 d，备用。选择长势良好且大小一致的两年生油茶苗40 株，分为8 组，对应8 个处理，每组5 株油茶苗，相当于每处理重复5 次。将配制好的药液分别喷施于各组油茶苗上，至叶片完全润湿止，并于首次喷药5 d 后喷施第2 次药液。于灭菌条件下，在预培养5 d 后的胶孢炭疽菌菌落边缘打取直径5 mm 的菌饼。于首次喷药后5 d (第2 次喷药前) 以及第2 次喷药后5、10、15、20、25 d 分别从每株油茶苗上取3 片新叶，进行刺伤后接种菌饼，置于37 ℃、相对湿度80%、遮光的培养室中培养，5 d 后按如下方法测量病斑面积。

将接菌叶片置于45 cm × 45 cm × 45 cm 小型黑色灯棚底部，在15 cm × 15 cm 玻璃片上标记出1 cm × 1 cm 标准面积，用玻璃片将叶片压展，在灯棚上端进行定焦距拍摄。将照片导入Autodesk Computer Aided Design (CAD)，利用CAD 软件选取病斑，计量病斑面积。采用Abbott 法[12]评价水杨酸与咪鲜胺混用对防治油茶炭疽病的增效作用。按照式 (1)、式 (2) 和式 (3) 分别计算防治效果 (Cobs，%)、理论防效 (Cexp，%) 和增效系数(SR)。

式 (1)～(3) 中：Lac为对照组病斑面积，cm2；Lat为处理组病斑面积，cm2；C1、C2分别为2 种单剂的实际防效，%。

SR＞1 为增效作用，SR＜1 为拮抗作用，SR=1 为相加作用[12]。

1.2.2 田间药效试验 试验在浙江省杭州市桐庐县分水镇油茶基地进行，3 年生白花油茶。

1.2.2.1 药剂配比及小区划分 试验共设6 个质量浓度处理，分别对应1.1.1 节中的SA、P1、P2、C1、C2 及对照 CK。每处理3 个小区，各小区随机区组排列，小区之间设保护行加以隔离。

1.2.2.2 施药时间和施药方法 田间试验方法参考江西省地方标准DB36∕T1128.4 - 2019 进行[13]。

采用3WBD-16 型背负式电动喷雾器 (单个空心圆锥喷头，喷孔直径1.3 mm，操作压力0.2～0.4 MPa，流量0.65～0.88 L/min)均匀喷雾施药，用药液量为2400 L/hm2。于2022 年6 月22 日油茶树炭疽病发生初期第1 次施药，7 d 后 (6 月29 日) 第2 次施药，全期共施药2 次。试验期间不采用任何其他防治措施。

1.2.2.3 药效调查 每小区随机调查5 株油茶树，每株调查3 枝油茶树梢的全部叶片，记录叶片总数、各级病叶数。按发病程度进行病情分级[13]：0 级，无病斑；1 级，病斑面积占整个叶面积的5%以下；3 级，病斑面积占6%～15%；5 级，病斑面积占16%～25%；7 级，病斑面积占26%～50%；9 级，病斑面积占51%以上。本研究于油茶炭疽病发生初期进行，施药前调查病情基数，于第1 次药后7 d (第2 次药前，6 月28 日) 及第2 次药后28 d (7 月26 日) 各调查1 次发病情况，共调查3 次。按照公式 (4) 和 (5) 分别计算病情指数 (Di) 及防治效果 (E，%)，部分小区因初始病情基数为0，按照公式 (6) 进行计算。

当初始病情基数不为0 时：

当初始病情基数为0 时：

式 (4)～(6) 中：Na为病级叶片数；a为该病级代表数值 (a= 1，2，3...，9)；N为调查叶片数；Dic0为空白对照区药前病情指数；Dic1为空白对照区药后病情指数；Dit0为药剂处理区药前病情指数；Dit1为药剂处理区药后病情指数。

1.3 数据处理

运用IBM SPSS Statistics 25.0 对病斑面积和防治效果进行差异显著性分析，并通过GraphPad 8.0 和Excel 2013 绘制结果图表。

2 结果与分析

2.1 室内增效作用测定

离体叶片接菌测定结果 (图1) 表明：第2 次药后5 d 和10 d，150 mg/L 水杨酸 + 200 mg/L 咪鲜胺 (C2)处理组的防治效果显著高于200 mg/L 咪鲜胺单独处理 (P2)，增效系数分别达到1.38 和1.42 (P＜ 0.05) (表1)，但与300 mg/L 咪鲜胺单独处理组 (P3) 之间却无显著性差异；第2 次药后5 d，150 mg/L 水杨酸 + 100 mg/L 咪鲜胺 (C1) 处理组防治效果显著高于100 mg/L 咪鲜胺单独处理(P1)，增效系数达到1.42，但与P2 组之间则无显著性差异；表明水杨酸与咪鲜胺混用后具有增效作用。第2 次药后20 d，C2 组防效为57.26%，150 mg/L 水杨酸 + 300 mg/L 咪鲜胺 (C3) 组防效为53.29%，显著高于P2 和P3 组，说明水杨酸与咪鲜胺混用可以有效延长防治持效期至首次施药后25 d。同时，C3 组当咪鲜胺质量浓度升高至300 mg/L 后，与水杨酸混用并未出现明显的增效作用，甚至在第2 次药后10 、15 和20 d，增效系数小于1，说明与水杨酸混用时，咪鲜胺浓度过高反而会降低防治效果。

表1 水杨酸与咪鲜胺混用对油茶炭疽病防治效果的增效作用Table 1 Synergistic effect of the mixture of salicylic acid and prochloraz on the control of anthracnose of C.oleifera

图1 离体叶片法测定水杨酸与咪鲜胺混用对油茶炭疽病的防治效果Fig.1 Relative control efficacy of the mixture of salicylic acid and prochloraz on anthracnose of C.oleifera determined by detached leaf inoculation test

此外，第1 次施药后5 d，水杨酸与咪鲜胺混用的增效效果并不明显，第2 次药后5 d 才逐渐表现出二者的增效作用，第2 次药后15 d，水杨酸与咪鲜胺混用处理组的防治效果显著高于咪鲜胺单独处理，说明水杨酸激活油茶的抗病性需要一定时间过程，当油茶被诱导产生抗病性后则可以保持较长时间，从而使得咪鲜胺的持效期延长。

2.2 田间防治效果

田间防治效果见表2。第1 次施药后7 d，150 mg/L 水杨酸 + 200 mg/L 咪鲜胺 (C2) 和150 mg/L 水杨酸 + 100 mg/L 咪鲜胺 (C1) 处理组的平均防治效果均显著高于200 mg/L 咪鲜胺 (P2)、150 mg/L 水杨酸 (SA) 和100 mg/L 咪鲜胺 (P1) 单独处理组；第2 次药后7 d，C2 组的防效显著高于P2，C1 组的防效显著高于P1 (P＜ 0.05)。即水杨酸与咪鲜胺混用的防治效果均高于单剂单独使用，说明将2 种药剂混合施用可以达到增强防效的目的。第2 次药后28 d，C1 和C2 组的防效均显著高于P1 和P2 组，表明将水杨酸与咪鲜胺混合施用延长了防治持效期。田间防效结果与室内试验结果一致。

表2 水杨酸与咪鲜胺混用对油茶炭疽病的田间防治效果Table 2 Field efficacy of the mixture of salicylic acid and prochloraz on anthracnose of C.oleifera

试验期间，观察发现各处理小区油茶树长势、株高、叶片形状和颜色等均与空白对照区无明显差异，表明在试验期间无药害现象发生。

3 小结与讨论

本研究通过在油茶苗上施药后再于离体叶片上接菌的方式，初步筛选出150 mg/L 水杨酸 +200 mg/L 咪鲜胺、150 mg/L 水杨酸 + 300 mg/L 咪鲜胺2 组防治效果显著的混用处理，证明了2 种药剂混用存在协同增效作用，并通过田间药效试验，确定了150 mg/L 水杨酸 + 200 mg/L 咪鲜胺混用时对油茶炭疽病的防治效果最佳，与室内生测结果一致。研究表明，水杨酸与咪鲜胺混用可提高对油茶炭疽病的防治效果并延长持效期，在田间应用后有望减少杀菌剂施药次数和降低施药浓度，从而减少杀菌剂的用量。

有报道表明，施用外源性水杨酸可以通过提高超氧化物歧化酶 (SOD)、过氧化物酶 (POD) 和降低过氧化氢酶 (CAT) 活性，减少脂质过氧化，有效防治芒果炭疽病[14]、甜樱桃青霉病[15]及山茶灰斑病[16]；可调控月季细胞壁中的防御系统，提高其抗黑斑病的能力[17]，并可有效延长月季切花瓶插寿命达6 倍[18]。王翠兰等[11]进行了水杨酸和咪鲜胺联合施用对油茶炭疽病防治的室内试验，发现水杨酸和咪鲜胺混用具有显著的增效作用，本研究结果与之一致。Takayoshi 等[19]利用噻菌灵(thiabendazole) 结合水杨酸诱导水稻产生系统获得性抗病能力，提高了药剂对水稻稻瘟病的防治效果，本研究结果与该报道也相似。有研究者对水杨酸的诱导抗病性进行了归纳，阐述了水杨酸与具有CAT 活性的水杨酸受体蛋白结合，抑制其CAT 活性，导致细胞内过氧化氢浓度升高，从而激活植物体内抗性基因表达的作用机理[1,20-22]，但目前聚焦到外源水杨酸对油茶诱导抗病性的研究还较少。后续我们还将针对不同阶段油茶叶片的抗病性相关生理指标进行测定，以探究其内在机理。

植物免疫诱抗剂通过提高植物自身抗逆性来抵御病虫害和不良环境条件的侵害，对解决化学农药过量使用造成的有害生物抗药性上升、农业生态环境污染和农产品质量安全等问题均有重要意义[20]。本研究明确了水杨酸和咪鲜胺混合施用可达到减药增效、延长持效期的目的，并筛选出了其最优配比为水杨酸150 mg/L + 咪鲜胺200 mg/L，结果可为油茶炭疽病防控新型绿色农药产品的研发生产提供新的思路和依据。