王超宇 龚宝成 靳燕 综述 赵强 审校

神经母细胞瘤（neuroblastoma，NB）是儿童最常见的颅外实体恶性肿瘤，起源于原始神经嵴细胞，可发生于交感神经系统的任何地方，最常见于肾上腺髓质。NB 占儿童恶性肿瘤的7%～8%，但在儿童癌症死亡中约占15%，被称为“儿童肿瘤之王”[1]。不同年龄、部位、疾病阶段、生物学特征等的NB 具有较强的异质性，预后差异较大。低中危NB 患儿预后较好，而高危组NB 患儿即使给予高强度联合治疗，预后依然较差，5 年生存率低于50%[1]。NB 的不同临床表现与其高度异质性直接相关，这种异质性是治疗失败和肿瘤复发的主要原因，而肿瘤细胞的干性（stemness）是导致肿瘤内异质性的决定因素之一[2]。肿瘤细胞的干性指的是肿瘤细胞能够持续保持未分化状态且具有自我更新能力的特性，而具有这些干性特征的肿瘤起始细胞亚群称为肿瘤干细胞（cancer stem cells，CSCs）[3]。

CSCs 及其干性特征在NB 的发生发展、治疗耐药、复发转移等过程中均发挥着重要作用。肿瘤中的干性细胞亚群可以导致肿瘤细胞的多样化，其通过产生不同分化阶段的肿瘤细胞，导致肿瘤组织中的细胞异质性。并且，分化的细胞也可以在特定条件下通过重编程去分化重新获得干性[4]。CSCs 通过在干性状态和非干性状态之间的可逆转换来显示其可塑性。已分化肿瘤细胞的重新编程是CSCs 的重要来源之一。此外，一个具有干性特征的肿瘤细胞可以分裂为两个子细胞，其中一个子代细胞能够发育为分化的肿瘤细胞，另一个则继续保持其干性特征[5]。在体外非贴壁依赖性的培养条件中，CSCs 表现为悬浮细胞球而非贴壁细胞，而其他大部分非干性细胞因没有贴壁的条件而通过失巢凋亡等途径死亡。

1 NB 中干细胞亚群标志物研究进展

从NB 细胞系中可以分离出N 型（Neuroblastic 型）、S 型（Substrate-Adherent 型）、Ⅰ型（Intermediate 型）3 种形态变异亚群，这些变异体具有不同的基因表达谱，并能够相互转化[6]。N 型NB 细胞为弱附着或漂浮生长，具有神经元标记蛋白，表现为弱致瘤性；S 型NB 细胞为接触抑制的单层生长细胞，具有非神经元的神经嵴衍生细胞标记蛋白，表现为非致瘤性；Ⅰ型NB 细胞的形态介于N 型和S 型细胞之间，且同时具有N 型和S 型细胞的标记蛋白。Ⅰ型NB 细胞具有独特的形态学、生化、分化和致瘤特性，其恶性程度明显高于N 型或S 型细胞，其致瘤性在无胸腺小鼠中比N 型、S 型细胞高出6 倍[6]。Ⅰ型NB 细胞高度表达CD133、KIT 等干细胞标志物，具有自我更新和多谱系分化的干细胞样特征，可以双向分化为N 型或S型NB 细胞。基于其侵袭性和分化潜能等特征，高度致瘤的Ⅰ型NB 细胞目前常被认为是NB 中的干性细胞亚群。

NB 中干性细胞亚群的鉴定可能具有挑战性，目前尚缺乏一致公认的特异性标志物[2]。但根据其干性特征，近年来已经提出许多潜在的细胞表面或胞内假定标志物。CD133 是最常用于识别儿童恶性肿瘤中干性亚群的细胞表面标志物[7]，并且CD133 的表达和MYCN 扩增被证明可以诱导NB 的化疗耐药并缩短患儿的平均生存时间。CD114 作为粒细胞集落刺激因子（granulocyte colony-stimulating factor，G-CSF）的受体，也是NB 中干性细胞亚群的潜在标志物之一[3]。KIT（+）细胞同样被认为构成了NB 中的干细胞样亚群，KIT（+）的NB 细胞比KIT（-）的NB 细胞具有更强的肿瘤侵袭性，复发患儿中干细胞样肿瘤细胞也显示出KIT 表达的增加[8]。侧群（side population，SP）细胞是指在Hoechst 33 342 染色中表现出特殊低染色模式的一组具有干细胞样表型的细胞亚群，在一些缺乏特异性标记的CSCs 研究中被广泛应用[7]。NB 中SP 细胞亚群被证实高表达GD2 和CD117（c-KIT）等，并表现出较强的复制增殖潜力、集落形成能力、治疗抗性等干性特征。此外，Nestin 和ABCG2 是神经前体细胞的标志分子，是最早用作描述NB 中干性细胞亚群的假定标志物[3]。因此，目前针对NB 细胞干性亚群的鉴定主要采用多种生物标志物联合细胞成球试验的方式进行双重验证。

2 NB 细胞干性与治疗抵抗

干性细胞亚群能够在多种常见的癌症治疗中存活，在肿瘤的治疗抵抗中发挥关键作用，对放疗和化疗等存在特定的抗性机制[9]。在药物治疗后的NB 细胞中会出现富含CSCs 的残留体。

标准化疗常通过诱导DNA 损伤导致肿瘤细胞死亡，而肿瘤细胞中的干性亚群具有高效的DNA 修复能力、活跃的细胞凋亡抗性和持续的干性特征，因此对传统的细胞毒性化疗具有耐药性。并且，化疗药物大多在肿瘤细胞的分裂期发挥作用，而部分具有干性特征的肿瘤细胞通常处于休眠或静止状态，可逃避多数化疗药物的杀伤，并成为化疗后复发的种子细胞[9]。NB 中的SP 细胞亚群高表达ABCG2 和ABCA3，具有药物外排泵的作用。ABCG2 和ABCA3 均是介导多药耐药 的ABC 转运蛋白（ATP-binding cassette transporter）超家族成员。ABC 转运蛋白通过其ATP酶活性，将药物分子排出细胞，降低胞内有效药物浓度，从而导致肿瘤细胞的多药耐药[7]。在MYCN 扩增的NB 细胞中，长时间应用阿霉素后，出现了高度富集的CSCs 亚群，导致对阿霉素的耐药性增强[10]。而伏立诺他可增强NB 细胞对化疗药物的敏感性，逆转其对阿霉素的耐药性。肿瘤细胞外泌体也可通过外排转运体将药物排至胞外，从而促进肿瘤细胞的多药耐药。近期研究表明CD73 可以调节抵抗治疗的NB 细胞的干性维持，CD73 高表达的NB 患儿预后较好[11]。

放疗可以通过电离作用直接损伤或通过产生活性氧（oxygen species，ROS）间接导致肿瘤细胞DNA损伤，是治疗恶性肿瘤的主要手段之一：1）CSCs 可以通过降低或清除ROS 来逃避电离辐射（ionizing radiation，IR）的杀伤作用；2）在乳腺癌、非小细胞肺癌、前列腺癌等肿瘤中已经证实，IR 可以诱导肿瘤细胞自我更新产生干性表型[12]。此外，处于不同周期的细胞对辐射的敏感性不同，G2/M 期细胞对辐射最敏感，而经历IR 的CSCs 可发生G2/M 期阻滞，以逃避辐射的杀伤作用。IR 还可以激活肿瘤转移的关键阶段—上皮间质转化（epithelial-to-mesenchymal transition，EMT），来促进肿瘤细胞的侵袭和转移[12]。MYC 家族成员与NB 的放射抗性和化学抗性相关。谷氨酰胺剥夺能够导致MYCN 和c-MYC 表达的下调，从而改变NB 干性细胞亚群的抗辐射特性；而将谷氨酰胺剥夺与放疗相结合，会导致MYCN 扩增的NB 中放射抗性细胞的增加，这与c-MYC 表达的上调有关[13]。恶性NB 细胞中较低的CALR 表达，与其更高的干性和更强的放疗抵抗相关[14]。治疗抵抗是导致NB 患儿治疗失败的主要原因，因此针对NB 的肿瘤干细胞的研究对于改善治疗效果具有重要意义（图1）。

图1 肿瘤干细胞的治疗抵抗及复发转移

3 NB 细胞干性与复发转移

有证据表明肿瘤转移始于具有干性特征的肿瘤细胞[15]。肿瘤细胞的干性使之具有无限的自我更新能力，因此在肿瘤原发部位的肿瘤干性细胞亚群能够促进肿瘤复发，而在远处存在的干性细胞亚群能够使转移性肿瘤重新生长。EMT 是干细胞的一个重要特征，并且是肿瘤转移的关键阶段。EMT 使细胞失去细胞极性，失去上皮表型，获得间质表型[15]。EMT 赋予细胞更强的转移和入侵能力，细胞迁移能力增强可被视为EMT 的标志之一[12]。EMT 发生后，神经细胞黏附分子（neural cell adhesion molecule，NCAM）表达量增加，使肿瘤细胞转移性增加。NB 中普遍表达NCAM，而NCAM 的表达与肿瘤更具侵略性的生物学行为如转移能力的增加、干性标志物的表达和预后不良有关[16]。

肿瘤细胞干性促进NB 复发转移的生物学过程受到多种机制的调节。Bmi-1 以浓度依赖性方式在控制Ⅰ型NB 细胞的自我更新和分化之间的平衡中起重要作用，可以促进Ⅰ型NB 细胞自发分化为S 型NB细胞；因此，降低Bmi-1 的表达可阻碍NB 中干性细胞亚群的分化，抑制NB 复发。STAT3 信号通路与NB 的复发转移密切相关，IGF1R 基因、G-CSF 等均可通过活化STAT3 信号通路来增强NB 细胞的致瘤性和转移等干性特征[3]。VAX939 作为TNKS1（Tankyrase 1）的抑制剂，可以通过抑制WNT 信号通路，抑制NB 中干性细胞亚群的迁移能力及CD133 的表达。LIN28B 通过调控与NB 侵袭及神经嵴样干性细胞相关的基因（如NANOG、OCT4、SOX2、NESTIN 等），影响NB 中干性细胞亚群的自我更新，进一步促进肿瘤转移[17]。L1 细胞黏附分子（L1 cell adhesion molecule，L1-CAM）被认为是NB 中干性细胞亚群的潜在标志物之一，其过表达可使肿瘤具有高度的致瘤性，使得肿瘤的自我更新能力和转移潜力增加，通过siRNA 转染下调L1-CAM 可显著抑制肿瘤细胞的增殖、迁移、肿瘤球的形成，从而提示其在干性细胞亚群的致瘤性和干性维持中发挥重要作用[3]。有研究报道，维替泊芬可以阻碍NB 中肿瘤起始细胞亚群的生长，抑制其干性特征，在维替泊芬处理后的转移性NB 中，肿瘤起始细胞的迁移和侵袭均减少[18]。

总之，NB 细胞的干性是其复发转移的主要原因之一，通过进一步探究干性促进NB 复发转移的明确机制，探索针对性干预措施，将为抑制NB 复发转移带来新的希望。

4 NB 细胞干性与肿瘤微环境的相互作用

肿瘤的发生发展及转移等过程与肿瘤细胞所处的内外环境，即肿瘤微环境（tumor microenvironment，TME）有着密切关系。其中CSCs 亚群赖以生存的特殊微环境称为肿瘤干细胞龛（cancer stem cell niche，CSC Niche）。CSC Niche 的特征包括缺氧、促炎、酸性、细胞外基质重塑等。

缺氧通过激活TGF-β 和WNT 信号通路抑制肿瘤细胞分化，创造了一个有利于低分化肿瘤细胞生存的微环境，从而促进肿瘤细胞干性的维持。NB 细胞在体外暴露于缺氧条件下可显著增加SP 细胞的比例，SP 细胞会向缺氧区迁移[19]。DLK1 在缺氧条件下的NB 中高表达，并在维持NB 细胞的干性表型中发挥作用[20]。缺氧会导致NB 细胞向未成熟和神经嵴样表型的去分化，暴露于缺氧环境的NB 细胞会出现缺氧诱导基因、神经嵴标志基因（c-KIT 和Notch-1 等）的上调，此过程与HIF 通路相关。缺氧也能强烈诱导CSCs 耐药，或可减弱肿瘤对化疗的反应，但其确切的作用机制仍需进一步探索和验证。

CSC Niche 中炎症细胞与肿瘤细胞之间的相互作用可能导致NB 的转移表型，并且放化疗后炎症的促进也是导致治疗耐药的原因之一。巨噬细胞是肿瘤免疫的重要组成部分，有M1 和M2 两种亚型。M1 巨噬细胞通常具有促炎和抗肿瘤作用；而M2 表型具有抗炎并促进肿瘤生长和侵袭的作用，是肿瘤相关巨噬细胞（tumor-associated macrophage，TAM）的主要组成部分[21]。TAM 与CSCs 及干细胞转化密切相关，转移性NB 中的TAM 含量较高，TAM 特异性基因（CD14、CD16、IL6、IL6R 等）的高表达与NB 的较差预后相关[22]。但近期也有研究结果提示M2 型巨噬细胞可能与NB 更长的生存期相关[23]。

肿瘤干性细胞亚群可分泌各种细胞因子和配体，将正常的成纤维细胞重编程为肿瘤相关成纤维细胞（cancer-associated fibroblasts，CAFs）[24]，CAFs 进而分泌多种生长因子，如肝细胞生长因子和CCL2，通过激活关键的干性调节因子WNT 和Notch 上调CSCs 的干性。与正常成纤维细胞不同，CAFs 在促进肿瘤生长、侵袭和血管生成等方面发挥重要作用。CAFs 已在多种肿瘤中被证实可以增强CSC 标志物的表达、促进肿瘤细胞干性、诱导EMT 以获得更强的侵袭性和转移扩散能力等[25]。CAFs 通常高表达基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs），MMPs 可重塑细胞外基质（extracellular matrix，ECM），与肿瘤生长、侵袭和转移有关。除了重塑ECM 外，MMPs 还被报道在炎症细胞趋化、血管新生等过程中发挥作用。MMP-14 敲低可抑制NB 细胞的迁移、侵袭和血管生成。

肿瘤血管新生也被认为是CSC Niche 的一个重要特征。NB 中干性细胞亚群更倾向存在于血管生成丰富的微环境中。同时，肿瘤干性细胞亚群也可以通过刺激内源性血管内皮细胞产生血管样结构来促进肿瘤血管生成[26]。通过抗血管生成来破坏其微环境或许是一种潜在的抑制NB 细胞干性的治疗手段。

综上，CSC Niche 有可能支持和启动肿瘤细胞中的干性程序；同时，干性细胞亚群也在不断改造CSC Niche 以维持适宜肿瘤生长的微环境（图2）。未来尝试将CSC Niche 重塑为抑制NB 细胞干性亚群存活生长的微环境，或能有效抵抗其干性特征的发挥，为NB 耐药、复发转移等问题提供新的解决思路。

图2 肿瘤干细胞龛与肿瘤细胞干性的相互作用

5 NB 细胞干性特征调控的研究进展

NB 细胞干性的维持受到多条信号通路在的调控。PI3K/AKT/mTOR 通路在大部分NB 中被激活，与干性细胞亚群的生物学行为高度相关。雷帕霉素、曲西立滨作为PI3K/AKT/mTOR 通路的抑制剂，可以显著抑制NB 中干性细胞亚群的存活、自我复制、迁移等干性行为[27]。WNT/β-Catenin 信号通路也被发现与NB 细胞的增殖、进展、迁移、耐药等干性特征的维持密切相关。WNT/β-catenin 通路抑制剂roniciclib 近期被证实能够通过诱导核仁应激来下调干性并抑制NB 细胞生长[28]。在NB 细胞系中，FZD6 作为WNT/β-Catenin 通路受体，其高表达的细胞亚群表现出高度致瘤的干性表型，而在FZD6-siRNA 敲低实验中其干性表型消失；类似地，FZD1 可介导多重耐药蛋白（multidrug resistance protein，MRP）外排转运体的表达，该转运蛋白赋予肿瘤细胞耐药性，而敲低FZD1 可降低MRP 的表达并恢复耐药肿瘤细胞的化疗敏感性。Notch 信号通路也是介导肿瘤细胞干性的关键机制，在NB 小鼠模型中，Notch 信号拮抗剂可抑制肿瘤血管生成并损害肿瘤活力[29]。

非编码RNA 在NB 细胞干性特征的调控中发挥重要作用。微小RNA（miRNA）与肿瘤细胞的自我更新、多药耐药、去分化重编程等干性特征的维持有关[30]。miRNA 在NB 细胞的分化中起着重要作用，如miRNA-124 在NB 干细胞中的过表达可诱导分化，同时其恶性潜能降低，而miRNA-335 可阻断NB 细胞的神经元分化。此外，选择性调控miRNA 的表达或可逆转NB 的治疗抵抗。如miRNA-21 可以促进NB 细胞增殖并支持其化疗耐药，miRNA-21 在顺铂耐药的NB 细胞中高度表达，而其选择性沉默可以促使化学致敏；miRNA-137 在阿霉素耐药的NB 细胞中选择性下调，而miRNA-137 的表达稳定或强化可以促进阿霉素化疗致敏。长链非编码RNA（lncRNA）lncNB1 能够与核糖体蛋白RPL35 相互作用促进NB形成，体外敲低lncNB1 可以消除NB 细胞的克隆能力，并在小鼠中导致NB 肿瘤消退[31]。

表观遗传调控通过对染色质DNA 或组蛋白进行甲基化等后天修饰，调节下游基因的表达，可以对肿瘤细胞的干性产生影响。m6A 甲基化可以调控非编码RNA 的表达和功能，从而控制肿瘤细胞的干性特性[32]。m6A 甲基化可增强骨肉瘤、结肠癌、非小细胞肺癌等肿瘤的药物治疗耐药性，导致预后不良。m6A 关键分子METTL3 和METTL14 可以促进肿瘤生长及其干性细胞亚群的自我更新。

综上所述，NB 细胞的干性特征受到多条信号通路、多种非编码RNA 以及转录后修饰调控等多种因素的影响，具有较为复杂的多层次调控机制。

6 结语与展望

NB 作为一种以高度异质性为特点的肿瘤，其治疗的难点和挑战在于其内存在很多不同基因型或亚型的NB 细胞。因此不同患者可以表现出不同的治疗效果及预后，甚至同一患儿体内的NB 细胞也存在不同的特性和差异。NB 异质性的主要来源就是干性细胞亚群的存在，因此深入研究其细胞干性的作用机制并寻找潜在的治疗靶点至关重要。

近些年的研究已经提供了关于NB 中干性细胞亚群的分子机制以及遗传和表观遗传变化的新进展，这些发现为靶向NB 干性细胞亚群的潜在治疗方式提供了新的思路。但是，靶向抑制NB 干细胞亚群的临床应用仍需进一步的深入探索。随着“综合治疗”理念的兴起和不断推广，个体化精准治疗已成为目前NB治疗的重点。未来，进一步了解NB 的复杂异质性，深入发掘干性亚群在NB 发生发展、治疗抵抗、复发转移等过程中的明确作用机制，寻找NB 干细胞亚群的特异性靶点，探索针对CSCs 及其干性的治疗新策略（如开发选择性抑制干性细胞亚群的靶向抗肿瘤新药物、或通过刺激静止的NB 干性细胞进入细胞周期等），是极具临床应用前景的研究方向，或能为NB 治疗带来新的突破。

本文无影响其科学性与可信度的经济利益冲突。