杨黎 刘孝焱 张茹 李爱恬 王莹 范菲菲 苗丽君 张毅

胸腔积液是一种常见的临床症状[1]，其产生原因包括：1）胸腔恶性肿瘤；2）感染，包括细菌性感染及结核性胸膜炎；3）循环功能改变，如心力衰竭[2-3]。临床上胸腔积液的获取相较胸腔穿刺活检具有获取方便、创伤小、手术风险低等优势，故被广泛采用进行相关生化检测作为指导临床诊断与病情评估的手段。

胸腔积液按性质可分为渗出液与漏出液，其理化性质与患者原发病密切相关。由循环系统功能障碍等导致的胸腔积液为漏出液，具有明显区别于其他原因导致的胸腔积液的理化特征，结合临床病史易于鉴别[4]。然而，恶性肿瘤导致的胸腔积液与结核、细菌等病原体感染导致的胸腔积液均为渗出液，理化特性相似，目前临床主要通过胸水沉渣包埋检测肿瘤细胞及检测肿瘤标志物进行辅助诊断[5-6]。然而，由于胸水沉渣包埋病理检测有所需样本量大（常为100 mL 以上）且肿瘤细胞数量稀少，明确发现肿瘤细胞概率低；肿瘤标志物检测也有特异性差，难以准确指导临床判断的缺陷；以及胸腔积液导致的胸闷、乏力等非特异性的临床表现常为患者就医的首发症状，临床上胸腔积液明确诊断难度大[7-8]。故对恶性肿瘤及感染所致胸腔积液中相关生化指标与临床诊断、预后相关的联系进行进一步探究具有重要的临床意义。

既往的研究表明，MPE 构成一个包含多种免疫细胞成分的肿瘤微环境，其中包含大量巨噬细胞，且具有较高比例的CD14+CD163+TAMs，与NMPE 具有明显差异[9-10]。本研究前期研究已经发现，TAMs 是一种能够提示临床诊断、预后及疗效的生化指标[11-12]。同时，既往研究提示肿瘤微环境中有较高水平的乳酸，且与肿瘤微环境的免疫抑制有关[13-14]；在恶性胸腔积液的肿瘤微环境内，高浓度的乳酸可以激活肿瘤相关巨噬细胞NE 代谢通路从而增强其免疫抑制作用，应用β受体阻断剂可以阻断巨噬细胞NE 信号转导，逆转免疫抑制功能并增强机体抗肿瘤免疫反应；有临床试验数据表明，在局部晚期黑色素瘤患者应用β 受体阻断剂联合免疫治疗可以提高患者疗效。因此，假设NE代谢通路与恶性肿瘤发生发展以及疗效预后具有关联。本研究通过对不同病因产生的胸腔积液进行NE 代谢通路相关生化指标的检测，并结合患者的临床诊断、预后情况进行分析，旨在探究胸腔积液中TAMs、乳酸及NE 水平与临床病理诊断、患者预后的关系，为胸腔积液的临床诊断与预后评估提供潜在的指标。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 临床资料 本研究胸腔积液样本来自2020 年4 月至2021 年5 月于郑州大学第一附属医院就诊的41 例患者，所有患者随访与临床预后评估截止至2022 年5 月。其中，NMPE 患者15 例，MPE 患者26 例。NMPE 诊断标准：1）结核性胸腔积液，ADA＞45 U/L；2）胸腔镜组织病理确诊结核，无恶性肿瘤相关指征；3）细菌感染性胸腔积液，临床症状及相关检查确认符合细菌感染者。MPE 诊断标准：病理诊断确诊为恶性肿瘤以及肿瘤标志物检测等临床检验结果明确支持。本研究方案通过郑州大学第一附属医院伦理委员会批准，样本的获取均经过临床医师与患者知情同意（伦理批件号2019-KY-256 肿瘤免疫微环境在肿瘤进展中的调控及机制研究）。

1.1.2 主要试剂与仪器 RPMI1640 培养基（美国Sigma 公司），胎牛血清（美国 Gbico 公司），PBS（美国Sigma 公司），人外周血淋巴细胞分离液（天津灏洋生物制品有限公司），胰酶（美国 Sigma 公司），70μm 滤网（美国 Biolegend 公司），人CD14 和 CD163 流式抗体（美国 Biolegend 公司），僵尸染料（死活染料，美国Biolegend 公司），乳酸检测试剂盒（美国BioVision 公司），去甲肾上腺素检测试剂盒（美国 Abbexa 公司），微量移液枪（美国 Eppendorf 公司），台式离心机（美国Thermo Fisher Scientific 公司），低温离心机（美国Thermo Fisher Scientific 公司），超净工作台（珠海造鑫仪器有限公司），流式细胞分析仪（美国贝克曼库尔特有限公司），酶标仪（美国Molecular Devices 公司）。

1.2 方法

1.2.1 胸腔积液的处理 收集胸腔积液样本，在冰上暂存及运输；经3 000 rpm 离心10 min，取上清液进行乳酸及NE 的定量检测；沉淀物使用PBS 溶液洗涤3 遍，用胰酶37 ℃消化10 min 后使用70μm 滤网过滤，使用含10%胎牛血清的RMPI 1 640 培养基洗涤并重悬为10 mL 的细胞悬液。将细胞悬液小心倒入等体积淋巴细胞分离液表面，动作轻柔以免扰动液面，再行2 500 rpm 离心25 min，离心完成后用吸管吸取整个白膜层，PBS 洗涤1 遍，此白膜层为单个核细胞层，包含所需的淋巴细胞。

1.2.2 流式细胞术 胸腔积液中获取的细胞用PBS 清洗2 遍，用PBS 重悬细胞，用死活染料进行染色15 min，然后4℃条件下1 500 rpm 离心5 min，弃上清。流式缓冲液重悬细胞后，加入抗人 CD14、CD163 流式抗体进行表面抗原染色，避光4℃孵育15 min。染色完成后使用PBS 重悬至单细胞后上机检测。

1.2.3 乳酸定量检测 按照乳酸检测试剂盒的说明书进行胸腔积液中乳酸的定量检测。制备标准曲线：依次加入0、2、4、6、8、10 μL 浓度为 1 nmoL/μL 的标准品，加入乳酸测定缓冲液调整体积至50 μL 使其达到0、2、4、6、8、10 nmoL/孔的浓度梯度；每孔加入反应体系混合液（乳酸测定缓冲液46 μL+酶混合液2 μL+探针2 μL）50 uL，室温避光孵育30 min，通过酶标仪读取570 nm 下的OD 值。样品检测：将胸腔积液上清在 4℃下4 000 rpm 离心 4 min，每孔加入5 μL 上清后加入乳酸测定缓冲液45 μL，加入反应体系混合液50 μL，室温避光孵育30 min，读取570 nm下的OD 值。

1.2.4 去甲肾上腺素定量检测 按照去甲肾上腺素检测试剂盒［Noradrenaline/ Norepinephrine（NA/NE）ELISA Kit］的说明书进行胸腔积液中NE 的定量检测，通过酶标仪读取450 nm 下的OD 值。

1.3 统计学分析

采用SPSS 22.0 和GraphPad Prism 8.0 软件进行统计分析以及图片构建。计量资料均采用 SPSS 进行正态性检验及方差齐性检验，经分析研究计量资料数据均符合正态分布或近似正态分布，组间样本采用独立样本t检验，数据以±s 表示。采用二元Logistic 回归分析确定区分良恶性诊断以及预后好差的独立危险因素；采用受试者工作特征曲线（ROC）分析TAMs 比例、乳酸水平、LDH 以及NE 水平对良恶性鉴别诊断、恶性疾病患者预后的预测效能，获取曲线下面积（AUC）、95% 置信区间、敏感度（sensitivity）、特异度（specificity）及临界值（cut-off value）。以AUC＞0.7 为结论具有准确性标准，以P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 胸腔积液中NE、乳酸及LDH 水平与良恶性胸腔积液鉴别诊断的关系

前期研究表明：TAMs 是一种能够提示MPE 临床诊断、预后及疗效的生化指标[11-12]；在MPE 中，乳酸能够通过激活NE 信号通路促进TAMs 的免疫抑制功能，因此假设乳酸以及NE 水平可作为胸腔积液临床诊断的预测指标。本研究收集临床MPE 及NMPE 样本，通过Elisa 定量检测获得其NE 浓度；通过流式细胞术获取其TAMs 占CD14+细胞的比例，结合临床胸腔积液相关检查检验结果获得胸水中乳酸、LDH 含量；并对其乳酸、NE 及LDH 水平与良恶性诊断的关系进行进一步分析。

2.1.1 良恶性胸腔积液患者临床资料与研究变量的组间比较 本研究共收集41 例临床患者的胸腔积液，将样本依据诊断分为MPE 和NMPE 两组。对年龄、NE 水平、乳酸、LDH 进行正态性检验，对符合正态分布的变量进行独立样本t检验，对不符合正态分布的变量进行非参数检验，发现两组的年龄、性别比较，其差异无统计学意义（P＞0.05）；NE 水平在MPE 中相较NMPE 组明显升高，其差异具有统计学意义（P＜0.05）；而乳酸、LDH 水平在良恶性胸腔积液之间的差异无统计学意义（表1）。

表1 两组间各临床资料与研究变量比较

2.1.2 MPE 的危险因素分析 以是否诊断为MPE为因变量（是=1，不是=0），以患者的性别、年龄、NE、乳酸、LDH 水平为自变量，进行单因素的二元 Logistic 回归分析，结果显示：NE 水平是与MPE 临床诊断相关的危险因素，OR=1.475，95%CI：1.061～2.050（P＜0.05）；患者的性别、年龄、胸腔积液中乳酸、LDH则未发现与良恶性诊断之间具有明显相关性（P＞0.05），见表2。

表2 二元Logistic 回归分析危险因素分析

2.1.3 NE 对恶性胸腔积液诊断的预测价值分析为衡量NE 作为良恶性鉴别诊断指标的潜力，将NE 作为良恶性鉴别诊断的预测指标进行ROC 分析。经ROC 曲线分析：MPE 中NE 的AUC、灵敏度、特异度及临界值为0.751、92.3%、53.3% 和1.239 ng/mL 且P＜0.05，具有较好的预测价值（图1）。

图1 NE 对MPE 诊断的预测价值分析

2.2 MPE 中TAMs 比例、乳酸及NE 水平与患者临床预后的关系

为进一步探究TAMs、乳酸-NE 代谢通路与患者临床预后是否有关联，是否可以作为预后评估潜在的预测指标，本研究将26 例MPE 样本按患者预后情况分为预后较好组与预后较差组，对其TAMs 比例、NE、乳酸、LDH 水平与患者临床预后间的关系进行分析。

2.2.1 患者临床资料与研究变量在不同预后组间的比较 根据患者临床治疗经过并充分结合其影像学等检查结果进行预后评估，患者的临床随访与预后评估工作均经临床医师协助及确认，将患者的预后情况分为部分缓解（partial response，PR）（共3 例）、疾病稳定（stable disease，SD）共14 例及疾病进展（progressive disease，PD）共9 例3 个等级，本研究所纳入临床患者中无完全缓解（complete response，CR）患者。

以PR、SD 为预后较好（治疗有效），PD 为预后较差（治疗较差）分为两组，对所研究变量进行正态性检验，对符合正态分布变量进行独立样本t检验，对非正态分布变量进行非参数检验，两组的年龄、性别比较，其差异无显著性意义（P＞0.05）；TAMs 比例、NE 水平在预后较差组中比预后较好组更高，其结果具有统计学意义（P＜0.05）；而乳酸、LDH 在两组间的差异无显著性意义（P＞0.05），见表3。

表3 两组间各临床资料与研究变量比较

2.2.2 MPE 中影响不良预后的危险因素分析 以患者预后好坏（预后较差=1，较好=0）为因变量，以患者的性别、年龄、胸腔积液中TAMs 占CD14+细胞的比例、NE、乳酸、LDH 水平为自变量，经单因素和多因素的二元Logistic 回归分析结果得出，TAMs 与NE均为影响不良预后发生的危险因素（P＜0.05）。单因素回归分析表明，TAMs 的OR=1.105，95%CI：1.004～1.216（P＜0.05）；NE 的OR=1.49，95%CI：1.039～2.137（P＜0.05）。多因素回归分析显示TAMs 的OR=1.118，95%CI：1.000～1.249（P＜0.05 ）；NE 的OR=1.819，95%CI：1.026～3.224（P＜0.05）。见表4。

表4 二元 Logistic 回归分析危险因素分析

2.2.3 MPE 中TAMs 及NE 水平对不良预后发生的预测价值分析 为进一步确定TAMs、NE 作为不良预后的预测指标的准确性，对其进行ROC 分析，结果提示：MPE 中TAMs 比例的AUC、灵敏度、特异度及临界值分别为0.856、77.8%、88.2%和17.7%（P＜0.05）（图2)；NE 的AUC、灵敏度、特异度及临界值分别为0.837、88.9%、82.4%和4.725 3 ng/mL（P＜0.05），均具有较好的预测价值。

图2 MPE 中NE、TAMs 对预后的预测价值分析

2.3 联合TAMs 比例、乳酸-去甲肾上腺素代谢通路相关指标对MPE 患者预后的预测价值分析

本研究推测将乳酸代谢、NE、TAMs 联合能够进一步增加其对患者临床预后的预测价值，利用多因素Logistic 回归模型建立ROC 曲线及参数估计的方法对其进行了进一步分析。

利用多因素的Logistic 回归模型，由TAMs、NE、乳酸的线性组合，计算得到其联合作为提示预后指标的预测概率。对所得的联合指标预测概率做非参数ROC 分析，结果提示：联合指标预测概率的AUC、灵敏度、特异度及临界值分别为0.928、100%、88.2%和39.50%（P＜0.05），相较TAMs 和NE 单独作为预测指标的AUC 更大，见图3。

图3 MPE 中TAMs 比例、NE 及乳酸、LDH 水平联合预测概率对预后评价的ROC 曲线

3 讨论

恶性肿瘤、感染所产生的胸腔积液中含有大量的免疫细胞成分，形成一个免疫微环境[15]。胸腔积液中组成部分包括细胞、代谢产物等，与患者原发疾病密切相关，对其进一步的研究有助于明确疾病性质以及评估患者预后[16]。MPE 中含有大量的TAMs，发挥免疫抑制作用，且对良恶性胸腔积液鉴别诊断与临床预后评估具有一定的提示作用。本课题组尚未发表的研究发现，肿瘤微环境中的乳酸可促使TAMs 的NE 代谢通路激活，并通过下游信号进一步增强其免疫抑制作用，应用β 受体（NE 的受体）阻滞剂可以拮抗这种现象。β 受体阻滞剂如普萘洛尔是一种常用于治疗交感神经兴奋或儿茶酚胺水平过高导致的心律失常、高血压的药物，而一项临床试验发现，恶性肿瘤患者在治疗中联用普萘洛尔可以改善患者的临床疗效[17-18]。NE 是人体中β 受体阻滞剂主要拮抗的儿茶酚胺物质，结合以上发现做出假设：NE 代谢通路在恶性肿瘤的发生、预后中可能发挥了某种作用，并对此假设进行了进一步的探究与验证。然而，β 受体阻滞剂对其他儿茶酚胺类物质也具有拮抗作用，其他儿茶酚胺的代谢也可能在恶性肿瘤发生发展及预后中发挥作用，需要更多的研究对其效应进行探究。

在本研究中，进一步探究胸腔积液中TAMs 比例以及乳酸-NE 代谢通路与临床诊断、预后之间的联系。结果表明：NE 也可作为一种潜在的鉴别诊断指标，相较于NMPE，其在MPE 中水平更高，与恶性疾病密切相关；而乳酸相关代谢产物如乳酸、LDH 则未发现与良恶性诊断之间具有明显相关性。相反，在本实验样本中观察到3 例感染性胸腔积液中的LDH 水平较高，远高于恶性组LDH 平均水平，结合本实验中所有患者胸腔积液样本的检测数据，发现LDH 水平具有较大的波动性。这是因为乳酸代谢与炎症反应关系密切，而感染性疾病与恶性肿瘤均可引起炎症反应，故难以通过乳酸代谢相关指标进行良恶性鉴别诊断，且由于其较大的波动性，难以取得较为可靠的结论[19]。

胸腔积液患者预后评估的相关分析中，TAMs 比例、NE 水平均与预后情况具有高度相关性，并可作为潜在的预后评估生化指标，较高的TAMs 比例及NE水平往往与不良临床预后联系紧密。而乳酸相关代谢指标与预后之间未发现明显相关性，考虑这是因为在肿瘤微环境中，相比于肿瘤高糖酵解代谢导致的高乳酸环境，TAMs 通过NE 代谢通路介导发挥免疫抑制功能从而促进肿瘤发展，TAMs 的代谢通路与功能改变在NE 代谢通路中发挥更为直接的作用[20]。联合上述指标对患者预后预测的准确性进一步提高，可以作为患者预后预测的新指标；同时也验证了NE 代谢通路所发挥的作用，为MPE 患者临床治疗方案及预后判断提供了新的思路。

本研究也具有一定的局限性。临床上胸腔积液仅出现于部分患者中，且胸腔积液患者中也仅有部分患者符合目前临床上进行胸腔穿刺引流的适应征，故收样具有一定难度。由于本研究收集样本例数有限，且仅为单中心研究，后续需要进一步扩大样本量以及多中心联合分析以提高结果的准确性。此外，由于样本收集阶段难以对患者后续的病情发展与治疗进行明确预测，尽管本研究所纳入患者均依据相关指南进行标准方案治疗，但难以保证所有对照组患者的治疗水平完全一致，可能会对预后的分析产生一定影响，有待后续进行更大规模的回顾性研究进一步验证。

综上所述，本研究通过对患者胸腔积液样本中相关生化指标与其临床病理诊断、预后的关系进行分析，发现NE 可作为一种潜在的良恶性胸腔积液鉴别诊断的指标。同时，MPE 中高水平NE 与患者的不良预后明显相关；TAMs 比例、乳酸及NE 联合，可以作为辅助判断MPE 患者临床预后的潜在指标。

本文无影响其科学性与可信度的经济利益冲突。