张培波，李 义

延安大学附属医院 泌尿外科，陕西 延安 716000

膀胱癌(bladder cancer,BC)是泌尿系统常见的恶性肿瘤,其术后复发率较高,且易产生耐药性[1]。因此,寻找新的治疗膀胱癌的药物尤为重要。沙棘(HippophaerhamnoidesL.)是广泛分布于中国西北地区的胡颓子科沙棘属植物,具有药食两用价值。沙棘总黄酮(total flavonoids ofHippophaerhamnoidesL.,HTF)是沙棘果实及叶子中黄酮的总称,其成分以槲皮素、异鼠李素和山奈酚等为主,具有抗氧化、抑菌、抗炎等生物活性[2-3]。近年来,HTF的抗肿瘤作用逐渐受到关注。研究显示,HTF可能通过阻滞细胞周期进程及调控Bax/Bcl-2表达抑制体外人前列腺癌细胞系PC-3增殖并诱导其凋亡[4];西藏HTF可能通过下调TGF-β和MMP9表达及阻遏上皮间质转化过程降低肺癌细胞系A549的迁移和侵袭能力[5]。然而,HTF对膀胱癌发生发展的影响还未知。

miR-144是一种微小RNA(microRNA,miRNA),参与多种疾病的发展进程。研究显示,在膀胱癌细胞系及临床癌组织中表达显著降低,上调 miR-144可靶向EZH2阻遏膀胱癌细胞增殖,miR-144可作为膀胱癌治疗的分子靶点[6]。但目前,HTF能否调控miR-144来影响膀胱癌细胞的恶性表型也还未知。本研究以人膀胱癌细胞系T24为研究对象,miR-144为切入点,观察HTF对T24细胞的影响及可能的机制,旨在为HTF治疗膀胱癌提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 细胞和主要试剂

人膀胱癌细胞系T24由中国科学院上海细胞库提供;沙棘总黄酮(HTF)(陕西森弗天然制品有限公司);胎牛血清(浙江天杭生物公司);二喹啉甲酸蛋白检测试剂盒、细胞计数试剂盒-8(cell counting kit-8,CCK-8)、RPMI 1640培养基(由北京索莱宝公司);LipofectamineTM2000试剂盒(Invitrogen公司);反转录试剂盒、miRNA抽提试剂盒、PCR试剂盒由大连宝生物公司提供;兔抗人β-肌动蛋白(β-actin)、B淋巴细胞瘤-2相关蛋白(Bcl-2-associated X protein,Bax)、B淋巴细胞瘤-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)抗体(Santa Cruz公司);PCR引物及抑制剂阴性序列(anti-miR-NC)、miR-144抑制剂(anti-miR-144)(上海吉玛制药公司)。

1.2 方法

1.2.1 分组与处理:T24细胞用RPMI 1640培养基(含10%胎牛血清)培养。取6孔板,接种T24细胞(2.5×105个/孔),用LipofectamineTM2000试剂盒分别将anti-miR-144、anti-miR-NC转染至T24细胞。将未转染的T24细胞分为对照组(常规培养)和低、中、高剂量HTF组(分别用含25、50、100 μg/mL[5]HTF的培养基培养)。将转染anti-miR-144的细胞分为anti-miR-144组(细胞用常规培养基培养)和anti-miR-144+高浓度组(用含100 μg/mL HTF的培养基培养)。将转染anti-miR-NC的T24细胞分为anti-miR-NC组(细胞用常规培养基培养)和anti-miR-NC+高浓度组(用含100 μg/mL HTF的培养基培养)。

1.2.2 CCK-8法检测细胞增殖:于96孔板中培养细胞(2.5×104个/孔)24 h后,添加CCK-8 10 μL,2 h后,用酶标仪测450 nm处的吸光度(A)值。

1.2.3 流式细胞测量术评价细胞凋亡:收集在6孔板(2.5×105个/孔)中培养24 h的各组T24细胞,依据annexin V-FITC/PI试剂盒的方法检测其细胞凋亡。

1.2.4 RT-qPCR检测miR-144表达:于6孔板中培养细胞(2.5×105个/孔)24 h后,根据miRNA抽提试剂盒说明书的操作步骤提取RNA,反转录后进行PCR反应。引物序列:miR-144上游5′-GCGTCAT AGTGTGCTGT-3′,下游5′-CGTAGGCTAGGCGAGCG AC-3′;U6上游5′-GCGGGCTGAGACTAGCGGACAA GC-3′,下游5′-CGATACGATACGCGCGTC-3′。2-ΔΔCt法计算miR-144相对U6的表达量。

1.2.5 Western blot检测Bcl-2和Bax蛋白表达:RIPA试剂提取各组培养24 h后的T24细胞中的总蛋白。使用二喹啉甲酸蛋白试剂盒测定蛋白浓度后,行SDS-PAGE以分离蛋白。然后进行转膜、封闭,并分别用Bax、Bcl-2和β-actin一抗于4 ℃冰箱中过夜孵育,其中一抗稀释度均为1∶1 000;再用羊抗兔二抗于37 ℃孵育1 h,二抗稀释度均为1∶2 000。然后,使用显影液进行显影并拍照。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 不同浓度HTF对膀胱癌T24细胞增殖活性的抑制作用

与对照组比较,不同浓度HTF降低了膀胱癌T24细胞A值(P<0.05)(表1)。

表1 不同浓度HTF对T24细胞增殖活性的抑制作用

2.2 不同浓度HTF对膀胱癌T24细胞凋亡的诱导作用

与对照组比较,不同浓度HTF降低了膀胱癌T24细胞凋亡率、Bax表达,增加了Bcl-2表达(P<0.05)(图1,表2)。

图1 Western blot检测Bax和Bcl-2蛋白表达

表2 不同浓度HTF对T24细胞凋亡的影响

2.3 不同浓度HTF对miR-144表达的影响

与对照组比较,不同浓度HTF干促进了膀胱癌T24细胞中miR-144表达(P<0.05)(表3)。

表3 不同浓度HTF对T24细胞中miR-144表达的影响

2.4 敲减miR-144可减弱HTF对膀胱癌T24细胞增殖、凋亡的影响

anti-miR-144组T24细胞中miR-144表达量为0.48±0.03,显著低于anti-miR-NC组(1.00±0.08,P<0.05),说明转染anti-miR-144的T24细胞中miR-144被敲减。anti-miR-144组与anti-miR-NC组比较,T24细胞A值、Bcl-2表达升高,凋亡率、Bax表达降低(P<0.05)。与anti-miR-NC+高浓度组比较,anti-miR-144+高浓度组T24细胞A值、Bcl-2表达增高,凋亡率、Bax表达降低(P<0.05)(图2,表4)。

图2 Western blot检测蛋白Bax和Bcl-2表达

表4 敲减miR-144可减弱HTF对T24细胞增殖和凋亡的影响

3 讨论

细胞凋亡受阻及细胞增殖的异常是导致膀胱癌发展的关键原因,因此阻滞其增殖、诱导凋亡对膀胱癌有明显的治疗作用[7]。近年来研究显示,从植物中提取的黄酮类物质具有抗肿瘤作用,具有开发为肿瘤治疗药物的潜在价值。例如,实验证明槲皮黄酮可通过抑制TAK1/JNK信号通路降低膀胱癌细胞的增殖能力,且促进细胞凋亡[8];毛蕊异黄酮可能通过阻碍PI3K/Akt信号通路的激活进而促进Bax表达来抑制膀胱癌T24细胞增殖,并加剧细胞凋亡[9]。本研究显示,25、50、100 μg/mL的HTF可阻碍T24细胞增殖,并诱导其凋亡,这可能是通过上调抗凋亡蛋白Bcl-2及下调促凋亡蛋白Bax实现[10],提示HTF具有治疗膀胱癌的潜在价值。miRNA能够调控细胞的增殖和凋亡,对癌症等的发生发展具有重要调控作用。既往研究显示,miR-186-5p[11]、miR-665[12]和miR-335[13]等多种miRNA是膀胱癌中表达下调的基因,这些miRNA发挥抑癌基因作用阻碍膀胱癌的发展进程;此外,膀胱癌中还存在一些表达上调的miRNA,如miR-20a[14]、miR-25[15]和miR-1290[16]等,这些miRNA发挥致癌基因作用促进膀胱癌的发展进程。这些研究说明,不同的miRNA对膀胱癌发生发展的影响不同。

miR-144是肾细胞癌[17]、结肠癌[18]和食管癌[19]等多种肿瘤中表达降低的一种miRNA,其作为抑癌基因分别靶向抑制CEP55、PBX3、TIGAR的表达阻滞这些肿瘤的发展进程。有报道称,血清miR-144低表达与患者肿瘤分期和淋巴结转移相关,可明显降低患者3年的总生存率,因此血清miR-144水平对膀胱癌的诊断和预后评估具有一定价值[20]。本研究显示,敲减miR-144促进了膀胱癌细胞增殖并阻碍了膀胱癌细胞凋亡,与文献[6]报道结果一致,提示miR-144也作为抑癌基因阻碍膀胱癌的发展进程,其可作为膀胱癌治疗的分子靶点。此外,本研究还显示,HTF对膀胱癌细胞中miR-144的表达具有明显的促进作用,而敲减miR-144减弱了HTF的抗膀胱癌作用,提示HTF可能通过增加miR-144的表达来影响膀胱癌细胞增殖和凋亡,但其调控的miR-144的靶基因还有待进一步探究。

综上,本研究结果表明,一定浓度的HTF可能通过靶向上调miR-144对膀胱癌细胞增殖具有抑制作用,而对其凋亡起促进作用,具有治疗膀胱癌的潜在价值。未来本研究将通过动物实验进一步验证HTF在体内对膀胱癌进展的影响。