杨为祝，刘 忠，张峰林，黄延林，孙 瑾，田新华

厦门大学附属中山医院 神经外科，福建 厦门 361000

垂体腺瘤约占颅内原发性肿瘤的15%,尸体解剖发现率甚至高达35%[1]。垂体卒中(pituitary apoplexy,PA)是指垂体腺瘤急性或亚急性出血、梗死或梗死后出血,超过60%表现为出血或出血性梗死[2]。突发失明和意识障碍为PA最严重并发症,致残率高[3]。因此,探讨垂体腺瘤出血性卒中的发生机制,提高PA的整体疗效具有重要临床价值。还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,NADPH)氧化酶(NADPH oxidase 4,NOX)是由多种亚单位酶组成的酶复合物,其中NOX4是中枢神经系统活性氧(reactive oxygen species,ROS)的重要来源[4],NOX4通过氧化应激催化产生ROS,后者参与细胞代谢、免疫、增殖、凋亡等生理过程[5]。本课题组前期研究表明,NOX4在大鼠脑缺血机械再通后出血转化中上调表达,抑制NOX4表达可减少ROS产生,从而减轻神经血管单元的凋亡和血脑屏障破坏,减少了颅内出血转化[6]。但NOX4在垂体腺瘤出血性卒中的作用尚不明确。因此,本研究拟探索NOX4介导的氧化应激在垂体腺瘤出血性卒中中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 临床标本来源:取厦门大学附属中山医院神经外科手术切除的剩余垂体腺瘤标本,根据患者症状、病史、影像学及术后病理,将组织标本分为出血卒中(strok,PA)组和非卒中(non-strok,non-PA)组,每组随机选取相应的组织标本18例。本研究已通过厦门大学附属中山医院伦理委员会审批[审批号:xmzsyyky伦审第(2022-029)],患者或家属均知情并签署知情同意书。

1.1.2 试剂和材料:NOX4抗体、二抗、蛋白质提取及蛋白质BCA测定试剂盒(Signalway Antibody公司);伊红、苏木精(北京索莱宝科技有限公司);2,7-二氯荧光素二乙酸酯活性氧荧光探针(2′,7′-dichlorodihydrofluortscein diacetate,DCFH-DA)活性氧检测试剂盒(南京峰峰生物医药技术有限公司贝博生物)和TUNEL凋亡试剂盒(上海白赛生物公司)。

non-PA.non-stroke group;PA.stroke group(scale bar=50 μm).

1.2 方法

1.2.1 HE染色观察形态:将卒中(PA)和非卒中(non-PA)标本行蜡块包埋, 4 μm切片,60 ℃烤片60 min。用二甲苯和梯度乙醇进行脱蜡复水,苏木素染色3 min后清水冲洗,再用0.1%盐酸乙醇分化10 s,流水滴洗。梯度乙醇脱水,伊红染色1 min,无水乙醇与二甲苯脱水透明后封片处理,在光学显微镜下进行组织染色情况及细胞形态观察。

1.2.2 免疫组织化学检测NOX4:将卒中(PA)和非卒中(non-PA)标本行蜡块包埋、切片、烤片、脱蜡复水处理;于95 ℃柠檬酸钠缓冲液中行抗原修复,再于3% H2O2中,温室孵育10 min。羊血清封闭60 min,加入NOX4一抗(1∶200),4 ℃孵育过夜,PBS清洗3次;加入对应的二抗(1∶1 000),室温孵育60 min,PBS清洗3次;行DBA显色与苏木精染色后再梯度脱水封片。在光学显微镜下拍照,图片用Image J软件行阳性细胞百分数评分。

1.2.3 Western blot检测NOX4蛋白:组织样品中加入裂解液与蛋白酶抑制剂,于匀浆机中研磨,冰上孵育30 min,提取上清液,4 ℃下以12 000 r/min离心10 min,吸取上清,BCA试剂盒检测蛋白质浓度,再将蛋白变性。行蛋白电泳分离蛋白质,湿转至PVDF膜,5%脱脂奶粉室温封闭膜60 min,加入NOX4(1∶1 000)、β-actin(1∶1 000)一抗4 ℃孵育过夜。TBST洗膜3次,加二抗(1∶10 000)室温孵育60 min。TBST洗膜3次,加入显影液后显影机显影条带,应用Image J软件行吸光度值分析。

1.2.4 组织ROS的检测:将卒中(PA)和非卒中(non-PA)标本行蜡块包埋、切片、烤片、脱蜡复水处理;滴加清洗工作液,室温孵育10 min;吸除清洗液,滴加DCFH-DA探针(1∶500),37 ℃避光孵育30 min,PBS清洗3次,封片,荧光显微镜检测荧光强度。

1.2.5 TUNEL检测细胞凋亡:将卒中(PA)和非卒中(non-PA)标本行蜡块包埋、切片、烤片、脱蜡复水处理;蛋白酶K(20 mg/L)37 ℃孵育10 min,PBS冲洗3次,滴加TUNEL Equilibration buffer,室温孵育5 min,去除后再滴加100 μL TUNEL反应混合物,湿盒中37 ℃孵育120 min,PBS冲洗3次。适量0.1% Triton-×100清洗3次,滴加浓度为2 mg/L的DAPI染液,室温避光孵育 10 min;去除染液,PBS清洗3次,滴加抗荧光淬灭液封片,荧光显微镜观察细胞凋亡率。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 患者一般情况及HE染色结果

垂体瘤出血卒中(PA)组和非卒中(non-PA)组各18例。出血卒中组,女性11例,男性7例,年龄为(46.5±9.4)岁。出血非卒中组,女性12例,男性6例,年龄为(42.4±11.2)岁。所有患者均行垂体磁共振平扫和增强扫描,2个神经外科主治医师根据磁共振影像测量肿瘤大小。出血卒中组肿瘤直径(3.66±0.86)cm与非卒中组(3.26±1.07)cm差异无统计学意义。非卒中组组织间未见红细胞,出血卒中组组织间可见大量红细胞渗出(图1)。

2.2 免疫组化染色检测NOX4阳性细胞百分数结果

出血卒中组表达的NOX4阳性细胞百分数显著高于非卒中组(P<0.001)(图2)。

The red mark in the figure represents the magnified point at this position, and the square represents the enlarged image; non-PA.non-stroke group; PA.stroke group; *P<0.001 compared with non-PA(scale bar=100 μm).

2.3 Western blot检测NOX4蛋白表达结果

出血卒中组NOX4蛋白表达水平显著高于非卒中组(P<0.001)(图3)。

A.1-3 non-stroke group, non-PA; 4-6 stroke group, PA; B.expression of NOX4 protein in non-PA and PA group; *P<0.001 compared with non-PA.

2.4 DCFH-DA探针检测ROS荧光强度结果

出血卒中组ROS平均荧光强度显著高于非卒中组(P<0.001)(图4)。

non-PA.non-stroke group; PA.stroke group; *P<0.001 compared with non-PA(scale bar=50 μm).

2.5 细胞凋亡情况

出血卒中组的细胞凋亡率显著高于非卒中组(P<0.001)(图5)。

A,D.green fluoresence was TUNEL staining, representing cell apoptosis; B,E.blue fluoresence was DAPI staining, representing cell apoptosis; C,F.combination of A and B/D and E;*P<0.001 compared with non-PA(scale bar=50 μm).

3 讨论

NOX4催化产生的ROS主要是H2O2[7]。以往研究表明,NOX4介导的氧化应激与脑缺血再灌注后血脑屏障破坏和细胞凋亡有关[8],而近期研究表明垂体腺瘤细胞缺氧后产生过量的ROS,进而诱导垂体腺瘤细胞凋亡,直接或间接破坏血管结构促进垂体腺瘤出血转化的发生[9]。但NOX4介导的氧化应激在垂体瘤出血性卒中中的研究尚未见报道。本中心是全国垂体瘤协作组委员单位,2003年开始开展神经内镜经鼻蝶垂体瘤切除术[10]。本研究在人体垂体瘤标本研究中发现,NOX4在出血卒中垂体腺瘤组织中的表达显著高于非卒中组织,且出血卒中组垂体腺瘤组织中的H2O2水平显著高于非卒中组,以上结果说明NOX4介导的氧化应激可能参与垂体瘤出血性卒中的发生。

为了进一步探索NOX4在垂体瘤出血性卒中中的作用。本研究通过TUNEL染色法检测发现出血卒中组垂体腺瘤组织中细胞凋亡程度显著高于非卒中组织。近期研究发现,催乳素处理大鼠垂体瘤细胞系MMQ后,其ROS水平较对照组上调,同时细胞凋亡程度也升高[11];此外,有研究表明在大鼠垂体瘤细胞系GH3和MMQ研究中发现,乌苯美司(ubenimex)诱导ROS生成,后者通过激活ROS/ERK通路,促进细胞凋亡[12]。以上研究说明氧化应激介导的细胞凋亡与垂体瘤发生发展相关。本研究发现出血卒中组的细胞凋亡程度较非卒中组更显著,结合以往研究和本研究结果, NOX4氧化应激介导的细胞凋亡可能是垂体瘤出血性卒中的潜在机制。

本研究首次发现NOX4介导的氧化应激参与垂体瘤出血性卒中的发生,且可能通过调控细胞凋亡的机制促进垂体瘤出血性卒中的发生。但本研究也有一定局限性,研究局限于人体标本,并未在垂体瘤细胞系和动物模型中深入验证。在后续的研究中,拟在MMQ和GH3细胞中建立出血细胞模型,同时建立大鼠垂体瘤出血性卒中模型。通过体内、外沉默NOX4,进一步探索NOX4在垂体瘤出血性卒中发生中的作用和潜在机制。