周 悦，林静娜

联勤保障部队第909医院，福建 漳州 363000

糖尿病(diabetes mellitus,DM)是全球最常见的代谢疾病,到2030年,糖尿病将成为人类死亡的第七大原因[1]。由于体内过高的血糖水平,糖尿病可引起一系列并发症,如微血管病变(视网膜病变、肾病和神经系统疾病)和大血管并发症(动脉粥样硬化)[2]。糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy,DR)主要表现为血管渗透性增加和血管闭塞,是成人视力损害和失明的主要原因[3]。微小RNA(microRNAs,miRNAs)是一种单链非编码RNA,在转录后水平上负调控基因表达[4]。新近的研究认为miRNAs在不仅在糖尿病发生过程中起到重要作用[5],一些miRNAs(miRNA-146、miRNA-195)参与了DR进展[6],而miR-199-3p在DR中的作用却未见报道。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 试剂:大鼠视网膜Muller细胞(美国菌种保藏中心),RNeasy试剂盒、Taq PCR Master Mix(中国Qiagen公司);miR-199-3p mimic、OE-VEGFA(GenePharma公司);Lipofectamine 2000(Invitrogen公司);SYBR® Premix Ex TaqTMⅡ(TaKaRa公司);RIPA裂解液(Solarbio公司);二奎啉甲酸(bicinchoninic acid,BCA)试剂盒(Thermo Fisher Scientific公司);右旋糖酐及其余试剂(Sigma-Aldrich公司)。

1.1.2 实验动物 无特征病原体(specific pathogen free,SPF)SD大鼠雄性,体质量200～250 g)[福建医科大学实验动物中心(SCXK-2021-03)],饲养在SPF级动物房内,温度(23±1)℃,昼夜循环12 h,动物均可自由进食进水。

1.2 方法

1.2.1 分组及处理:大鼠被随机分为7组 :1)对照(Ctrl)组;2)糖尿病模型(model)组;3)Ctrl+miR-199-3p 阴性对照(miR-NC)+过表达VEGFR对照(OE-Con)(Ctrl+miR-NC+OE-Con)组;4)model+miR-NC+OE-Con(model+miR-NC+OE-Con)组;5)model+miR-199-3p-抑制剂(miR-inhibitor)+OE-Con(model+miR-inhibitor+OE-Con)组;6)model+miR-199-3p模拟物(miR-mimc)+OE-Con(model+miR-mimc+OE-Con)组;7)model+miR-mimc+过表达VEGFA(OE-VEGFA)(model+miR-mimc+OE-VEGFA)组,每组12只。模型大鼠通过单次注射链脲佐菌素(STZ,65 mg/kg)建立糖尿病模型,对照大鼠注射等体积0.9%氯化钠溶液。上述各组病毒(Lentivirus)由上海吉凯基因公司制备并在预实验中验证了相应的感染效率及效果。病毒在造模后注射至大鼠玻璃体(5 μL,3 μmol/L)内,6周后重复注射并在3个月后取材并进行相关分析。为了确定造模的成功,在造模结束后随机选取3只动物,左心室注射50 mg/mL FITC标记的右旋糖酐。摘取眼睛后用4%的多聚甲醛固定切片,在荧光显微镜(ZEISS)下观察视网膜组织以确定实验动物模型血管的变化。所有动物实验都遵从动物福利3R原则,本实验通过联勤保障部队第909医院伦理审核。阴性对照载体(miR-NC)、miR-199-3p 模拟物(miR-mimic;10 pmol/L)、过表达VEGFA载体(OE-VEGFA;2 mg/mL),经Lipofectamine 2000转染视网膜细胞(Müller细胞系)。

1.2.2 视网膜细胞的培养:将大鼠视网膜Müller细胞,在37 ℃和5% CO2的细胞培养箱中于DMEM培养基,培养并添加10% FBS,100 U/mL青霉素和100 U/mL链霉素。

1.2.3 视网膜组织的获取:处死大鼠后,快速摘除眼球,10%甲醛浸泡12 h,随后 获得游离视网膜组织,用于TUNEL染色,Image J软件统计。

1.2.4 RT-qPCR检测miR-199-3p和VegfA的mRNA:用RNeasy试剂盒从视网膜组织中提取总RNA并通过Fermentas:K1622试剂盒反转录成cDNA,在Taq PCR Master Mix体系中将cDNA用作RT-qPCR模板进行荧光PCR,在PCR体系中添加SYBR® Premix Ex TaqTMⅡ,采用2-△△Ct法进行量化分析。

1.2.5 双荧光素酶基因报告分析靶向关系:取对数增殖期视网膜细胞接种于96孔板中(1.5×104),37 ℃、5% CO2培养24 h。然后将miRNA mimic以及对照病毒通过Lipofectamin2000转染细胞。培养6 h后更换培养基,加入PLB裂解液置摇床20～30 min。将上清液转移至不透光96孔酶标板中, 加入100 μL预先混好的Luciferase Assay Reagent Ⅱ,检测荧光素酶反应强度。

1.2.6 Western blot检测VEGFA、TGF-β1、HGF、PEDF、GAPDH蛋白:RIPA裂解细胞后取全蛋白质并用BCA试剂盒进行蛋白质定量,取相同体积蛋白质样品SDS-PAGE分离。电泳结束后蛋白质转移至硝酸纤维素膜上,脱脂奶粉封闭。随后加入一抗(anti-VEGFA, 稀释1 000倍,anti-TGF-β1,稀释500倍,anti-HGF,稀释200倍,anti-PEDF,稀释500倍,anti-GAPDH,稀释1 000倍)4 ℃孵育过夜,第2天加入HRP偶联的二抗(稀释1 000倍)4 ℃孵育1 h。ECL法显影曝光,胶片扫描后Image J软件扫描吸光度值。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 糖尿病大鼠视网膜病理改变以及miR-199-3p表达变化

糖尿病模型大鼠视网膜毛细血管扩张,血管弯曲,间质水肿,视网膜直径不规则。而对照组大鼠视网膜血管分支光滑,直径均匀(图1A)。相比于对照组,糖尿病模型大鼠视网膜组织中,miR-199-3p表达水平显著降低(P<0.01)(图1B)。

A.representative images of retina(×200);B.expression of miR-199-3p in retina; *P<0.01 compared with Ctrl.

2.2 miR-199-3p 与VegfA的靶向关系

模型大鼠视网膜组织中VEGFA表达显著升高(P<0.001)(图2A),TargetScan在线软件筛选了其潜在靶点,发现VegfA为其靶点之一(图2B)。在WT组视网膜细胞中,转染了miR-199-3p mimic组的VegfA相对荧光素酶活性显著降低(P<0.001)(图2B)。

A.expression of VEGFA in retina; B.identification of VegfA as potential target of miR-199-3p and relative luciferase activity of Wt and Mut; *P<0.001 compared with Ctrl or miR-NC.

A.TUNEL results of retina cell(×100); B.statistic results of apoptosis rate of retina cell; *P<0.001 compared with Ctrl+OE-Con;#P<0.001 compared with model+miR-inhibitor+OE-Con; △P<0.001 compared with model+miR-mimic+OE-Con.

2.3 miR-199-3p对糖尿病大鼠视神经的影响

糖尿病大鼠视网膜凋亡显著升高(P<0.001),敲低miR-199-3p后凋亡程度进一步加重,而过表达miR-199-3p后凋亡程度降低(P<0.001),然而过表达miR-199-3p同时过表达VEGFA表达后,糖尿病大鼠视网膜凋亡显著升高(P<0.01)。

2.4 miR-199-3p抑制视网膜病变

糖尿病大鼠视网膜组织中VEGFA、TGF-β1和HGF表达显著升高(图4,P<0.001),PEDF表达显著下降(P<0.001)(图4)。过表达miR-199-3p后,糖尿病大鼠视网膜组织中VEGFA、TGF-β1和HGF表达显著降低, PEDF表达升高(P<0.01)(图4)。

A.Western blot results; B.VEGFA;C.TGF-β1;D.HGF;E.PEDF; *P<0.001 compared with Ctrl+OE-Con;#P<0.01, ##P<0.001 compared with model+miR-inhibitor+OE-Con; △P<0.01 compared with model+miR-mimic+OE-Con.

同时过表达miR-199-3p和VEGFA后可显著减轻这些蛋白的表达变化(P<0.01)。

3 讨论

随着糖尿病在全球的流行,DR患者也日益增多,新的治疗手段对DR患者的额康复具有十分重要的意义。本研究结果发现在单次注射链脲佐菌素可引起大鼠视网膜病变,同时发现miR-199-3p 表达降低。双荧光素实验结果显示,VegfA是miR-199-3p的作用靶点,干扰VEGFA可逆转miR-199-3p过表达对视网膜的损伤。

微小RNA(miRNA)是一类小的非编码RNA现在的研究发现,miRNA参与调节胰岛β细胞的功能,并且糖尿病状态下细胞内miRNA表达会发生变化[5]。miRNA有望成为糖尿病视网膜病变治疗的潜在靶点。miR-199-3p 在糖尿病小鼠心肌组织中表达异常[7],在糖尿病患者尿液中低表达并可用于诊断微量白蛋白尿与大量白蛋白尿患者[8],也有研究显示,miR-199-3p在葡萄糖诱导的胰岛β细胞中上调[9],其在糖尿病中的作用仍需深入探究。本研究实验结果显示,糖尿病模型大鼠视网膜组织中miR-199-3p 表达显著下降,这与报道的实验结果相一致[7-8],而与另一篇文献的实验结果相悖[9]。与此同时还发现VEGFA在模型大鼠视网膜组织中表达升高,随后的双荧光素酶实验验证了VegfA和miR-199-3p的靶向关系。

血管内皮细胞主要参与血管形态、稳态和功能的调控,血管生成主要受到VEGF调控[10]。新近的研究表明,VEGFA在糖尿病微血管病变中起到重要作用。VEGFA在糖尿病大鼠肾脏中表达显著升高[11],同时发现糖尿病大鼠视网膜内核层及节细胞中VEGFA表达显著升高[12],一些研究也表明,VEGF基因、miR-199-3p与DR的严重程度密切相关[13]。

视网膜GCL细胞是视网膜中输出视觉信号到大脑视觉中心的最终神经元,神经节细胞死亡直接导致了视力损失[14]。通过HE和TUNEL染色实验发现,miR-199-3p 过表达可显著降低GCL细胞数目并增强视网膜细胞凋亡。同样,蛋白质免疫印迹实验结果显示,miR-199-3p 过表达后视网膜病变相关蛋白TGF-β1和HGF表达显著降低,PEDF表达升高。而过表达miR-199-3p同时过表达VEGFA表达后可逆转这些蛋白的表达。然而近期的研究结果显示,VEGFA既可以促进血管新生也可以诱导血管退化[15],VEGFA在糖尿病视网膜病变中具体是促进血管新生还是诱导其退化还需要进一步研究。

综上,本研究发现miR-199-3p 通过靶向VegfA抑制糖尿病大鼠视网膜病变,为DR治疗提供了新的靶点。