曾燕坤，洪小颖，陈清林

1.泉州医学高等专科学校 健康学院，福建 泉州 362000；2.福建医科大学 医学技术与工程学院，福建 福州 350004；3.福建医科大学附属泉州第一医院 检验科，福建 泉州 362000

BECN1是自噬过程中的关键基因,编码卷曲肌球蛋白样BCL2结合蛋白1(coiled-coil myosin-like BCL2-interacting protein,Beclin 1)[1]。由于自噬在肿瘤发生发展中具有双刃剑作用,Beclin 1在不同肿瘤生长、转移中的作用颇具争议[2-3]。目前,在白血病中对BECN1的研究相对较少,而关于其对白血病细胞增殖、迁移等的作用,更是鲜有报道。细胞外基质(extracellular matrix,ECM)的降解是肿瘤细胞转移的重要环节,而基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMPs)是发挥这一作用的一组关键酶[4]。其中,MMP 2与MMP 9作为MMPs家族的重要成员,在肿瘤细胞增殖和转移中尤为重要[5]。因此,本研究拟通过靶向BECN1的shRNA慢病毒感染,建立BECN1稳定下调的白血病THP-1细胞株,观察THP-1细胞增殖、侵袭和迁移能力变化,并初步探讨其作用机制与MMPs的关系。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞系:人白血病细胞系THP-1(武汉普诺赛生物技术有限公司)。

1.1.2 试剂及试剂盒:胎牛血清(Gemini公司);RPMI 1640(Hyclone公司);靶向BECN1的特异性shRNA和阴性对照慢病毒(上海吉玛制药技术有限公司);嘌呤霉素(Amresco公司);Trizol(Invitrogen公司);PCR引物(上海尚亚生物技术有限公司);RT-qPCR试剂盒(上海翊圣生物科技有限公司);RIPA细胞裂解液、BCA蛋白浓度测定试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司);Beclin 1、MMP 2、MMP 9、GAPDH等一抗及HRP标记二抗(武汉三鹰生物技术有限公司);MTT试剂盒(Genview公司);Matrigel基质胶和Transwell小室(8 μm)(Corning公司);瑞氏-吉姆萨染液(珠海贝索生物技术有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞的分组及处理:所有细胞在37 ℃、5% CO2的条件下,用含 10% 胎牛血清的 RPMI 1640 培养液培养,2～3 d 换液 1 次。将 THP-1 细胞分为:不加病毒对照组(control)、慢病毒阴性对照组(negative control,NC),慢病毒BECN1干扰组(BECN1-shRNA)。

1.2.2 慢病毒构建、感染及稳转株筛选:设计靶向BECN1的特异性短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)(siRNA 序列: 5′-CCCGTGGAATGGAATG AGATT-3′)及阴性对照(siRNA 序列: 5′-GTTCTCC GAACGTGTCACGT-3′),与载体pGLV3/H1/GFP/Puro连接,将重组质粒与慢病毒包装质粒共转染HEK-293T细胞后获取慢病毒颗粒。取对数增殖期NC和BECN1-shRNA组THP-1细胞,按照慢病毒操作手册优化确定的感染复数(MOI)=50,添加 Polybrene 条件进行感染。观察各组细胞中绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)表达以评估感染效率,经1.5 μg/mL嘌昤霉素筛选并扩大培养后得到稳转株,收集细胞进行下游实验。

1.2.3 RT-qPCR检测mRNA表达:收集各组细胞,Trizol法提取总RNA后反转录成cDNA,按照试剂盒说明操作,反应体系为 20 μL,每个样本均设 3 个复孔,以 ddH2O 为空白对照,使用 ABI 7500 PCR 仪进行扩增(95 ℃预变性10 min;95 ℃变性15 s,60 ℃退火/延伸1 min,共40个循环)。以GAPDH为内参,采用2-ΔΔCt法计算BECN1mRNA的相对表达量。GAPDH引物序列:F:5′-TCTCTGCTCCTCCTGTTC-3′;R:5′-GCCCAATACGACCAAATCC-3′,BECN1引物序列:F:5′-GGTGTCTCTCGCAGATTCATC-3′;R:5′-TCAGTCTTCGGCTGAGGTTCT-3′。

1.2.4 Western blot检测蛋白质表达:收集各组细胞,RIPA法提取总蛋白质,BCA法蛋白质定量。加入适量5×loading buffer,金属浴煮沸10 min使蛋白质变性,12% SDS-PAGE凝胶电泳分离后转至NC膜,5% 脱脂奶粉室温封闭后加入一定比例稀释的对应一抗Beclin 1(1∶1 000)、MMP 2(1∶1 500)、MMP 9(1∶1 500)、GAPDH(1∶2 000),4 ℃ 孵育过夜后TBST洗膜,加入 1∶5 000 稀释HRP标记二抗,室温孵育2 h,TBST洗膜后用ECL显影,Bio-Rad凝胶成像仪曝光。使用Image J分析蛋白质条带吸光度(A)值,目的蛋白质条带与相应内参GAPDH吸光度值之比代表各目的蛋白质相对表达量。

1.2.5 MTT法检测细胞增殖能力:将各组THP-1细胞以5×103个/孔接种于96孔板(培养体积200 μL),每组设 3 个复孔,同时设置空白对照孔。分别于培养 24、48、72、96 h后加入 MTT试剂20 μL/孔,孵育4 h后离心弃上清,加入Formazan溶解液150 μL/孔,振荡10 min,酶标仪测定490 nm波长处各孔A值。各组与对照组A值的比值即为细胞相对增殖率(%)。

1.2.6 Transwell小室法检测细胞侵袭能力:将100 μL Matrigel基质胶均匀铺于Transwell小室,在培养箱中塑形成薄膜。对数增殖期各组THP-1细胞于实验前无血清培养12 h,上室加入细胞悬液200 μL,下室加入600 μL含10% 胎牛血清的RPMI 1640。24 h 后取出小室,从上室方向擦净小室底部,甲醇固定10 min,瑞氏-吉姆萨染色5～10 min,PBS液漂洗,干燥后观察,随机选取 5 个低倍镜(×100)视野,计数细胞数后取平均值,以此代表细胞的侵袭能力。

1.2.7 Transwell小室法检测细胞迁移能力:无需铺Matrigel基质胶,其余细胞种板步骤同上,培养24 h,吸弃上室液体,用下室内的培养液将小室背面附着的细胞冲洗入下室中,混匀,观察细胞迁移情况。取100 μL 至 96 孔板中,设 3 个复孔,每孔加入 MTS 试剂 10 μL,置于培养箱 3 h,在酶标仪上读取490 nm及 630 nm双波长的A值,并计算平均值,以此代表迁移细胞数目及活性。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 慢病毒介导BECN1下调的THP-1细胞稳转株的筛选建立

慢病毒感染后经嘌呤霉素筛选48 h,阴性对照组和BECN1-shRNA组THP-1细胞表达GFP的细胞可达 90% 以上,而对照组未见GFP表达(图1)。

BF.bright field of view;FF.fluorescent field of view;scale bar=100 μm.

2.2 THP-1细胞BECN1表达水平下调的鉴定

与对照组、阴性对照组相比,BECN1-shRNA组THP-1细胞中BECN1mRNA表达和Beclin 1蛋白表达水平均明显下调(P<0.05)(图2)。

*P<0.05 compared with control;#P<0.05 compared with NC.

2.3 下调BECN1对THP-1细胞增殖能力的影响

与对照组、阴性对照组相比,BECN1-shRNA组THP-1细胞在48、72及96 h的相对增殖率均明显下降(P<0.05)(图3)。

*P<0.05 compared with control;#P<0.05 compared with NC.

2.4 下调BECN1对THP-1细胞侵袭能力的影响

与对照组、阴性对照组相比,BECN1-shRNA组THP-1细胞种板 24 h 后穿膜的THP-1细胞数明显减少(P<0.05)(图4)。

*P<0.05 compared with control; #P<0.05 compared with NC; scale bar=100 μm.

2.5 下调BECN1对THP-1细胞迁移能力的影响

与对照组、阴性对照组相比,BECN1-shRNA组THP-1细胞种板 24 h 后迁移到下室的细胞数减少,其A值明显下降(P<0.05)(图5)。

*P<0.05 compared with control; #P<0.05 compared with NC; scale bar=100 μm.

2.6 下调BECN1对THP-1细胞MMP 2和MMP 9蛋白表达的影响

与对照组、阴性对照组相比,BECN1-shRNA组THP-1细胞中MMP 2和MMP 9蛋白表达量均明显降低(P<0.05)(图6)。

*P<0.05 compared with control; #P<0.05 compared with NC.

3 讨论

白血病细胞髓外浸润(extramedullary infiltration,EMI)是白血病复发的重要原因之一[6]。增殖、侵袭和迁移是肿瘤细胞转移发展的前提,白血病的EMI与实体肿瘤转移一样,需要突破ECM这一天然屏障,从而穿透血管壁[7]。因此,对白血病细胞增殖、侵袭和迁移及其机制的探讨,是克服白血病发生EMI,改善患者预后的巨大挑战之一。

自噬可影响转移的各个环节来促进肿瘤细胞恶性转移[8]。BECN1作为调控细胞自噬水平的关键基因[1],其在不同肿瘤细胞中具有截然相反的作用:例如,在胃癌细胞中上调BECN1表达能促进自噬,并明显抑制细胞增殖、侵袭与迁移能力[2];而下调乳腺癌细胞[3]中BECN1表达,可降低癌细胞自噬水平,进而削弱其侵袭与迁移。已有研究表明Beclin 1蛋白与白血病的发生发展、耐药机制等有关[9],然而关于BECN1与白血病细胞EMI的研究甚少。用siRNA干扰Beclin 1表达后,K562/IMA耐药细胞的增殖、侵袭能力下降[10]。

急性单核细胞白血病是发生EMI的最常见一种白血病类型,发生率20%～40%,肝、脑等出现EMI是其最严重的并发症和死亡原因之一[11]。THP-1是人急性单核细胞白血病来源细胞系[12],本研究选取THP-1细胞为模型来观察BECN1在白血病增殖、侵袭和迁移中的作用,具有重要意义。成功构建了BECN1稳定下调的白血病THP-1细胞后,生物活性实验证实下调BECN1可明显减少THP-1细胞增殖速度、侵袭和迁移细胞数。那么其潜在机制可能与哪些分子有关?

基质金属蛋白酶MMPs属于ECM降解酶家族,其中MMP 2和 MMP 9作为明胶酶,是唯一能够降解Ⅳ胶原酶的水解酶,在肿瘤细胞转移过程中起主要作用[13]。据报道,MMP 2和MMP 9参与了白血病细胞增殖和迁移过程[14]。因此,为探讨下调BECN1抑制THP-1细胞恶性生物行为的可能机制,本文进一步采用Western blot检测发现MMP 2和MMP 9蛋白表达水平均明显下降。这意味着下调BECN1可能通过降低MMPs的表达来抑制THP-1细胞增殖、侵袭和迁移能力。

综上,本研究为靶向BECN1未来应用于白血病治疗提供了初步的实验和理论依据。但目前仅进行了体外细胞实验,关于BECN1下调在体内白血病细胞EMI中是否具有同样的抑制作用,尚缺乏实验证据,待后续研究报道。