金晓霞，陆晓云，刘玉山，梁李娜

1.南通大学附属肿瘤医院 病理科，江苏 南通 226000；2.厦门市海沧医院 肾内科，福建 厦门 361026

膀胱癌(bladder cancer, BC)是泌尿生殖系统常见的恶性肿瘤之一,占全部恶性肿瘤约3.2%[1],发病率居中国泌尿系统肿瘤首位[2]。其中,膀胱尿路上皮癌(urothelial bladder cancer,UBC)占90%以上,非肌层浸润性UBC在经尿道电切联合化学治疗药物膀胱内灌注后都可以得到有效控制,而已有肌层浸润的患者即使经膀胱根治性切除联合化学治疗也无法有效控制病情,并且很快发生复发转移,预后极差[3]。因此,找到新型、特异的分子标志物对于有效遏制UBC起关键作用。

沉默信息调节因子2(silent information regulator 2, SIRT2)属于Sirtuins家族,Sirtuins家族有7个成员,分别为SIRT1-7,通过水解移除组蛋白或非组蛋白赖氨酸残基上的乙酰基,是一类赖氨酸去乙酰基蛋白[4]。SIRT2在胞质中去乙酰化微管蛋白α-tubulin,在胞核中去乙酰化组蛋白残基H4K16、H4K20等,在有丝分裂过程中起稳定染色体的功能[5]。已有报道SIRT2在乳腺癌[6]、结直肠癌[7]、非小细胞肺癌[8]等恶性肿瘤中起重要作用,但其在UBC中的表达及作用还不明朗。本研究从SIRT2在UBC中的表达入手,探索SIRT2与UBC患者病理特征的关系,揭示SIRT2对膀胱癌细胞增殖、侵袭迁移的作用,为膀胱癌治疗提供新的靶点。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病例资料:回顾性收集2013年至2018年南通大学附属肿瘤医院病理科UBC患者组织95例,其中39例进行全膀胱切除,56例经尿道膀胱肿瘤电切,39例全膀胱切除标本同时取其癌旁组织。75例为男性,20例为女性,年龄40～83岁(66±9)岁。根据WHO 2016病理分级:55例为低级别、40例为高级别。根据UICC 2009版TNM分期:70例为非肌层侵袭组(T1)、25例为肌层侵袭组(T2-T4)。所有患者术前均未接受放射、化学治疗。该研究获得南通大学附属肿瘤医院伦理委员会批准(伦理审批号:2019-006)以及患者的知情同意。

1.1.2 细胞及主要试剂:人膀胱癌细胞系(J82, T24, 5637)和正常人膀胱尿路上皮细胞系(SV-HUC-1)(中国科学院上海细胞培养所);?偀?抗单克隆抗体SIRT2(Proteintech公司);GAPDH抗体(CST公司);一抗稀释液和PBS缓冲液(北京中杉金桥公司);二抗和显影液(Dako公司);RPMI1640培养基、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶(Gibco公司);CCK8检测试剂盒(Invitrogen公司);细胞培养板、Transwell小室(Corning公司);SIRT2干扰病毒(lentivtrus)(shSIRT2)及其阴性对照(shcon)(上海吉凯技术有限公司制作)。

1.2 方法

1.2.1 免疫组化检测及判读:将5 μm厚的石蜡包埋组织切片在二甲苯中脱蜡30 min,然后依次经70%、80%、95%、100%乙醇梯度脱水,10 min/道。用蒸馏水冲洗后,浸泡在0.1 mol/L柠檬酸缓冲液中100℃煮沸30 min,进行抗原修复。冷却后经PBS缓冲液冲洗,随后在切片组织上滴加一抗SIRT2(1∶100稀释),室温孵育2 h。用PBS缓冲液冲洗,滴加二抗,室温孵育30 min。再次用PBS冲洗,然后用DAB显色,蒸馏水冲洗。最后用苏木精复染,中性树脂封片。为了证明SIRT2表达的特异性,以PBS代替一抗作为阴性对照。

由2名病理科副主任医师采用双盲法独立进行免疫组化结果判读。SIRT2主要分布于细胞质中,少量分布于细胞核中。根据染色范围评分,每张切片在400倍镜下随机选取5个视野,每个视野计数约500个细胞,计算各视野中阳性细胞数的平均百分数:≤1%定为0分,>1%～10%定为1分,>10%～50%定为2分,>50%～75%定为3分,>75%定为4分。根据染色强度评分:未着色定为0分,淡黄色定为1分,黄色或棕黄色定为2分,棕黄色或棕褐色定为3分。将两项得分相乘,0分为阴性表达,1～2分为低表达,3～6分为中等表达,>6分为高表达。

1.2.2 细胞的培养:将膀胱癌细胞及正常膀胱尿路上皮细胞在添加10%胎牛血清的RPMI1640培养基中进行培养,置于含5% CO2的37 ℃培养箱中,2 d换液1次,适当传代。

1.2.3 CCK8法检测细胞增殖:取对数期细胞,胰蛋白酶消化后计数,96孔板中每孔加入100 μL细胞悬液,培养板在培养箱中培养48 h后,PBS漂洗每孔细胞,后立即加10 μL CCK-8试剂/孔,培养箱内孵育1～2 h。在避光条件下,酶标仪读取波长450 nm处各孔的吸光度(A)值,绘制曲线。

1.2.4 集落形成实验检测细胞集落形成:取对数期增殖的细胞,胰蛋白酶消化后计数,1 000个/孔种植于6孔板内,每5 d更换1次培养基,培养2周。4%多聚甲醛固定30 min,结晶紫染色,最后计数。

1.2.5 Western blot检测膀胱癌组织、癌旁组织及膀胱癌细胞中SIRT2蛋白表达:冰上裂解组织,收集蛋白,进行定量。在泳道中加样,随后电压100 V进行电泳。当溴酚蓝跑到凝胶底部后进行转膜,恒定电流300 mA,1 h。转膜后,置于5%脱脂奶在室温下封闭1 h。稀释一抗SIRT2(1∶1 000),4 ℃下孵育过夜。第2天用TBS-T缓冲液摇洗3次,每次5 min。随后室温孵育二抗2 h,TBS-T再次摇洗3次,每次5 min。最后,ECL显色,胶片曝光。

1.2.6 Transwell小室法检测细胞迁移:取对数期的细胞接种于6孔板,48 h后,使用胰蛋白酶消化制成细胞悬液,计数板计数。用基培重悬细胞,调整细胞至1×106/mL。在Transwell上室加入100 μL细胞悬液,下室加600 μL含10%胎牛血清的完全培养基。置于培养箱24 h后,弃除上下室的培养基,棉签轻擦上室的细胞,下室加PBS漂洗3次。用10%预冷的多聚甲醛固定细胞5 min,将小室移至新的培养板中,加入0.5%结晶紫溶液染色5 min,随后再次用PBS漂洗3次。取出小室,倒扣在载玻片上,显微镜下观察移到下层的细胞,计数100倍镜下、5个视野的穿膜细胞数,拍照。

1.2.7 Transwell小室法检测细胞侵袭:用无血清培养基稀释融化Matrigel,加60 μL 在Transwell上室,在Matrigel凝固后,在上室加入用基培稀释的细胞悬液,其余步骤同1.2.6。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 SIRT2在UBC组织中高表达

在UBC组织中,SIRT2主要表达在细胞质及细胞核中(图1)。在癌组织中SIRT2阳性表达率显著高于癌旁黏膜组织(P<0.05)(表1)。

表1 SIRT2在UBC组织中的表达分析

图1 免疫组化检测SIRT2在膀胱尿路上皮癌及癌(UBC)旁组织中的表达

2.2 SIRT2的表达与病理学参数的相关性

低级别组UBC中SIRT2表达的阳性率显著低于高级别组,表明SIRT2与UBC的病理分级呈正相关。T1组(非肌层侵袭组)中SIRT2的阳性率低于T2-T4组(肌层侵袭组),表明SIRT2与UBC的临床分期呈正相关。以上结果表明,UBC病理分级越高、临床分期越晚,SIRT2表达水平越高(表2)。

表2 SIRT2的表达与UBC临床病理特征的关系

2.3 SIRT2在UBC组织及细胞中高表达

在12对UBC组织及癌旁组织中,SIRT2蛋白均显著高表达(图2A)。膀胱癌细胞系(J82, T24, 5637)中SIRT2的mRNA及蛋白表达水平均高于正常膀胱尿路上皮细胞系(SV-HUC-1),其中T24细胞表达最高(图2B、C)。

A.SIRT2 protein was significantly over-expressed in 12 pairs of UBC tissues(T)and the paracancerous tissues(N); B.mRNA expression level of SIRT2 in bladder cancer cell lines(J82, T24, 5637)and normal bladder uroepithelial cells(SV-HUC-1); C.protein expression level of SIRT2 in bladder cancer cell lines and normal bladder uroepithelial cells;*P<0.05 compared with SV-HUC-1 cells.

2.4 敲减SIRT2对细胞增殖的影响

选取SIRT2表达最高的T24细胞,利用慢病毒感染稳定敲减SIRT2基因(图3A,B)。抑制SIRT2表达后,T24细胞集落形成能力显著下降(图3C,D)。下调SIRT2后,细胞增殖能力明显降低(图3E)。

A,B.mRNA and protein expression of SIRT2 was stably knocked down using lentiviral infection; C,D.ability of T24 cells to form colonies was significantly reduced after inhibition of SIRT2 expression; E.CCK8 assay showed that the cell proliferation ability was significantly reduced after SIRT down-regulation; *P<0.05, **P<0.01 compared with shcon group or 0 day.

2.5 敲减SIRT2对T24细胞侵袭、迁移能力的影响

稳定敲减T24细胞中的SIRT2,侵袭、迁移至下室的细胞数量明显减少,表明敲减SIRT2可以抑制膀胱癌细胞侵袭、迁移(图4)。

*P<0.01 compared with shcon group.

3 讨论

膀胱癌是中国泌尿生殖系统常见的恶性肿瘤之一,发病率居男性泌尿系统肿瘤首位[2]。膀胱癌高发年龄为50～70岁,男性发病率约为女性的3倍。

虽然大约70%的膀胱癌患者最初为非肌层侵袭,其5年复发率仍高达30%～80%,并且10%～25%最终会进展为肌层浸润性膀胱癌[3]。肌层侵袭性膀胱癌的侵袭和转移能力很强,病死率很高。因此,找到促膀胱癌发生发展及侵袭转移的关键因子将能有效遏制其发展,改善预后。众所周知,细胞衰老缺陷是肿瘤发展的一个重要因素,因此,靶向识别抗衰老基因有可能预防和抑制肿瘤的发生[9]。

Sirtuins家族成员可以调节细胞衰老、基因沉默、能量代谢、肿瘤发生发展等一系列生理及病理过程[4]。目前研究最多的是SIRT1,课题组也报道过SIRT1在乳腺癌发生发展及耐药中的作用[10]。近年来,SIRT2因为具有与SIRT1相似的作用底物及功能而受到越来越多的关注。SIRT2主要存在于细胞质,但在有丝分裂期可以穿梭至细胞核,具有在有丝分裂过程中稳定染色体的功能[5]。已有报道SIRT2通过去乙酰化H4K16、H3K56、α-tubulin、PR-Set7、NF-κB基团p65、FOXO和受体作用蛋白RIP1等,调控细胞周期、细胞凋亡和压力反应等过程[11]。研究表明,SIRT2在肿瘤发生发展过程中扮演重要角色。SIRT2在某些癌中表达下调,研究发现SIRT2表达缺失的小鼠更易罹患肿瘤,SIRT2敲除后,雌性小鼠易发生乳腺癌、雄性小鼠则易发生肝癌和肠癌[12]。同时,也有报道SIRT2抑制剂具有抗癌作用,SIRT2在抗肿瘤治疗中发挥重要作用[7-8]。因此,SIRT2在肿瘤中的功能与肿瘤细胞所处微环境及其上下游的作用底物有关,并与其去乙酰化功能密不可分。

综上所述,SIRT2在膀胱癌组织中表达上调,并与肿瘤级别高、分期晚呈正相关。干扰SIRT2可有效抑制肿瘤细胞增殖、侵袭及迁移。因此,一方面,通过SIRT2的表达水平可能可以提早预测膀胱癌是否会发生肌层侵袭;另一方面,靶向抑制SIRT2可以阻止肿瘤细胞的增殖及侵袭转移,从而成为一种新的、有效的治疗膀胱癌的方法。