林司杭 周文斌

暨南大学第二临床医学院 深圳市人民医院甲乳外科，广东深圳 518020

BRCA1/2基因突变可以导致乳腺癌、卵巢癌等风险增加。BRCA1和BRCA2突变携带者患乳腺癌累积风险分别为72%和69%，对侧乳腺癌累积发病率分别高达83%和62%；15%～22%的卵巢癌由BRCA1/2基因突变导致，且终身危险度由1%～2%升至60%～70%；BRCA1/2突变携带者的一级亲属患前列腺癌风险是正常人群1.7倍；故BRCA1/2基因检测对癌症的早期发现、预后等有重要意义[1]。

目前携有BRCA突变癌症患者可从铂类药物及腺苷二磷酸核糖聚合酶（poly ADP-ribose polymerase，PARP）抑制剂等获益。研究表明铂类药物可延长BRCA突变携带者的无进展生存期。携带BRCA1/2胚系突变的三阴性乳腺癌患者对铂类药物较敏感，而对紫杉醇类药物有抗性。在Ⅲ期试验中，发现BRCA1/2胚系突变的三阴性乳腺癌患者对铂类药物客观反应率及无进展生存期均高于紫杉醇。2018年1月美国批准奥拉帕尼（Olaparib）治疗携带BRCA突变的人表皮生长因子受体2（epidermal growth factor receptor 2，HER-2）阴性的转移性乳腺癌。Ⅲ期临床试验发现奥拉帕尼组可降低携有BRCA1/2突变的转移性激素受体阳性或三阴性乳腺癌患者42%的疾病进展风险、延长无进展生存期约2.8个月[2-3]。

BRCA1/2基因检测技术历经了低通量的第一代测序、高通量二代测序，再到如今单分子第三代测序。三代测序在不同时代背景下开发出来，有各自优缺点。第一代测序尽管有成本高、低通量、应用局限等缺点，但目前仍为基因检测金标准。二代测序则弥补一代测序的不足，具备测序速度快、通量高等优势。但也存在短读长的技术短板。三代测序最大特点是能单分子测序，具有读长变长、测序时间减少等优势。且不需进行PCR扩增，这能有效避免PCR偏好性导致的错误测序[4-5]。

对于BRCA突变阳性患者，由于国内外人群特征、医疗水平、临床指南不同等原因，导致BRCA1/2基因检测应用有所差异。笔者将综合阐述当前BRCA基因应用的最新进展，从而可以更好地为精准医疗服务。

1 BRCA1/2变异测序技术的发展历程

在过去的20年内，每一代基因测序在规模、通量等都有了极大的发展。1975年Frederick Sanger发明的“双脱氧链终止法”及Walter Gilbert在1977年提出的“化学测序法”，意味着第一代测序出现。

一代测序存在通量低、成本较高等问题，无法满足当前分子生物学等对于高通量、高效率、高产出的测序需求，从而衍生出如今的二代测序。2005年Roche公司推出以焦磷酸合成测序法为原理的454平台，其利用乳胶系统对DNA分子进行扩增，避免了传统方法的烦琐步骤，实现了大规模并行测序。Life Technologies公司在2008年推出的半导体测序很快在外国测序市场响应，ABI公司SOLiD测序受其影响逐渐没落。华大基因作为中国本地测序公司，在2014年发明了二代测序仪器—BGISEQ-1000型号，其优势体现在大规模DNA测序和小RNA分析，但转录组分析的性能仍需进一步完善[6-8]。

2010年前后，可满足长读长和快速测序的三代测序平台开始兴起。2008年Helicos Bioscience公司发明的Heliscope测序平台以单分子测序技术为基础；同年，ONT公司推出新型纳米孔单分子测序仪器，因为机器还不稳定，还需反复检测，故还不能投入市场；Pacific Bioscience测序平台2009年发明的单分子实时测序技术可以对特定的模板进行检测，满足实时测序的需求[9]。

2 BRCA1/2一代基因测序平台原理和优缺点

Sanger测序法，又称第一代测序技术，釆用直接测序的方法对各碱基荧光标记进行DNA序列分析，方法简便易行，结果直观。至今仍作为各基因突变检测方法的金标准。一代测序检测片段最长可达800～1000 bp，且有很高精确度，可达99.999%。一代测序由于对于长片段基因操作上较难实现、费时费力、消耗大量成本等问题，限制了其广泛应用。

3 BRCA1/2二代基因测序平台原理和优缺点

下一代测序技术即二代测序，是当前适合BRCA基因变异的检测技术。二代测序可未知序列时，对DNA片段进行测序；可同时检测多基因来指导肿瘤的早期预防及给予患者更加精准的个体化治疗。

当前国内外二代测序平台参差不齐，有各自优劣势，在临床及基础医学有不可替代的地位[10-11]。

3.1 Roche/454测序平台

Roche公司推出以边合成边测序技术为原理的454焦磷酸测序，是当前第一台较为稳定的测序平台，其主要采用焦磷酸测序法。该项测序技术的测序原理大致为将模板进行PCR扩增后，与相应的引物、DNA聚合酶等共同孵育进行酶促反应。在酶促反应中，会释放出焦磷酸基团和产生光信号，然后被电荷耦合元件光学系统捕捉并读取DNA序列信息。该平台精确度较高、耗时间较短和效率高。由于测序成本较高，限制了其在市场的普及。

3.2 Life/SOLiD测序平台

SOLiD平台原理为连接法和双碱基编码。在测序过程更换引物及替代了之前的聚合酶连接反应，双碱基编码对测序错误进行校正，来提高测序的精准度。与GS FLX测序相像，在PCR扩增和构建文库上，都用磁珠接头来检测DNA序列。不一样的方面是SOLiD平台的磁珠比GS FLX小得多。当前SOLiD系统称其测序准确度大于99.94%[12]。

3.3 Ion Torrent测序平台

Ion Torrent的核心技术为半导体技术。测序大致是将DNA链锚定在半导体芯片的微孔上，然后加入碱基，过程会释放出氢离子。通过对H+的检测，实时判读碱基。Ion Torrent平台可测定DNA片段的合成，减少了CCD扫描等操作，从而耗时短。检测H+可以大大提高碱基判读精准性，同时测序成本较低；其劣势为读长较短及测序准确率不高[13]。

3.4 华大基因CG平台

CG平台测序原理为DNA纳米芯片技术，测序大致为将DNA纳米球锚定在芯片上，然后通过探针锚定分子连接技术来检测DNA序列。CG平台推出的从头拼接技术，能够检测等位基因杂合子突变，其灵敏性高；为降低探针和酶的浓度，平台利用的是组合探针锚定连接法技术。其优势为可一次性读取数个碱基，减少耗时。每次检测都不因前一次测序结果影响，所以不会出现错误累积。但读长较短是其不可避免的短板。

3.5 不同二代测序平台的比较分析

不同二代测序平台各有特点，在通量、读长、准确率及成本等各有表现。罗氏454作为最早测序仪，读长较长，运行较快。但成本较高、错误率也较高；SOLiD测序仪用于外显子和基因突变测序，测序准确率较高，然而读长较短，运行较慢，目前已淡出市场；Ion Torrent测序平台准确率较高，测序成本低，但读长较短。若单个碱基出现得多则产生许多的H+，使pH值降低，导致测序不精确；华大基因CG平台碱基读取完全独立，可降低错误率，且价格低，不足之处为读长较短。

4 BRCA1/2三代基因测序平台原理和优缺点

2008年，三代测序技术诞生。弥补了第二代短读长，无法完整解析复杂重复序列的短板。三代测序不需要依赖PCR技术，测序压缩至数小时内。其最大特点为单分子测序技术。但目前仍处于技术发展期，其碱基识别准确度仍有较高错误率且成本较高，限制其大规模应用。目前国内外占主流的三代测序平台有SMRT测序、纳米孔SMS测序平台、SMS测序平台及SFRET测序平台[14-15]。

4.1 Heliscope测序平台

Helicos Bioscience公司的单分子测序平台，其推出市场上第一个三代测序仪，主要原理为边合成边测序（sequencing by synthesis，SBS）技术，测序步骤大致为：①将DNA大片段剪成小片段后加尾；②含接头的文库通过末端尾巴固定在探针完成装载；③延伸DNA模板链，并释放荧光信号；④电荷耦合元件收集光学信号。其避免了扩增时引入错配碱基以及扩增偏好性[16]。但存在短读长的技术短板，且设备要求较高。目前尚未得到广泛的应用。

4.2 SMRT测序平台

SMRT测序是目前使用率较高的技术。零级波导的纳米结构和dNTP荧光标记为其检测基础。在构建文库时，模板与引物结合，将荧光标记的dNTP加入微反应器延伸DNA模板链，设备收集荧光信号和测序。该平台在读长上实现了较大的突破，读长能达到30 kb。且对GC重复区、碱基修饰区保持高识别精确率。其短板为过分依赖单分子释放的荧光信号，从而检测精确率较低，仅为87.5%。

4.3 纳米孔SMS平台

2014年，英国ONT公司推出MinION测序平台，测序大致步骤：①马达蛋白与接头连接在待测模板一端；②带有接头的DNA及混合物加载至流动池；③马达蛋白将双链DNA解旋为单链通过纳米孔；④不同碱基产生不同电信号，由传导电子元件等处理和确定碱基信息。

4.4 FRET测序平台

FRET平台测序大致过程为标记的脱氧核苷酸分子随着测序引物延长会释放荧光信号，由荧光收集设备收集和测序。该平台测序时长较短，且读长较长。测序准确率相对于其他三代测序平台较高。由于该仪器缺乏具体的应用参数，目前尚未得到广泛应用[17]。

4.5 不同三代测序平台的比较分析

由于各三代测序平台建数据库和仪器原理等存在差异，导致通量、读长、测序准确率以及成本等有差异。当前三代测序共存特点为不依赖PCR构建文库、成本低、读长长及耗时短；Heliscope测序为第一个商品化的平台，其技术短板为短读长，且测序过程中信号较弱容易产生测序误差，导致准确率降低，从而限制其应用；MinION测序平台读长长、检测周期较短为其优势，但该测序仪器错误率较高，准确率仅65%～88%，目前该测序平台尚未得到广泛的应用。纳米孔SMS平台由传导电子元件等处理和确定碱基信息，读长可达10 kb。由于碱基前进速度具有随机性，间隔太短时碱基识别易错失，导致较高错误率，准确率仅为65%～88%，限制了其应用。FRET测序平台耗时短，且检测精确率较其他平台较高，缺乏具体应用参数，故应用范围极少[18]。

5 各代测序平台比较

三代测序技术在不同时代开发出来，有各自优缺点。相比二、三代测序，一代测序釆用直接测序，操作简易，且有极高的精确度，可达99.999%。目前仍作为各基因突变检测的金标准，可验证其他检测筛查出来的变异。然而，对于长片段基因，操作上较难实现，消耗大量时间和成本。

相比一代测序，NGS方法测序通量更高、应用领域更广，能检测BRCA基因的全部外显子，能完成各种突变类型的分析。但有不少问题，譬如，PCR一定程度提高假阳性率，且具有测序偏好性。其次，目前很多机构开展NGS检测，但检测服务良莠不齐，质量难以保证。

三代测序最大特点是单分子测序，相比前两代测序，改善有：①读长变长；②测序流程简化，测序时间短；③避免PCR造成的扩增偏好；④可测定碱基修饰情况。其短板为检测错误率较高、技术不成熟，且分析数据过分依赖软件处理[19]。

6 国内外BRCA1/2基因检测比较

①相比于美国、日本等发达国家，目前国内BRCA1/2基因检测比例非常低，就乳腺癌患者来说，检测比例不超过10%，大部分集中于大医院，而中小医院基本没有做，部分中小医院医生甚至不知道其意义，以及不知如何提供遗传咨询和预防措施；②目前国内尚无中国人群的突变数据库，国内医院或者外部检测机构评估BRCA1/2基因是否突变，主要参考国外的大样本数据数据库，而非国内人群的突变数据库。由于国内外人群的差异，检测结果准确性尚待商榷；③国内医院很少BRCA1/2基因检测。大部分为外部检测公司承包，检测水平参差不齐，尚无质控部门对结果进行把关，故结果稳定性不足；④国内不管医院还是外部检测公司，测序平台、变体解释等方面存在巨大差异，差异可以归因于国内检测实验室缺乏标准统一的检测指南[20]。

7 目前BRCA1/2基因检测的现状及存在的问题

目前基因检测存有不少的局限与弊端。①对BRCA1/2的认识不够透彻，如5%的BRCA突变基因类型为未知变异，与疾病的关系也未知，导致检测结论不确定；②国内外指南对BRCA突变的解读不一致，导致部分结论存在争议；③国内BRCA1/2基因检测采用不同方法，可能导致结果不一致；④由于肿瘤具有异质性，譬如不同肿瘤细胞之间的基因突变谱不同等，故每一次结论可能存在差异[21]。

8 BRCA1/2基因突变携带者预防性措施

癌症患者通过BRCA1/2基因检测确定携有BRCA基因突变。目前这些患者可以通过保乳治疗、预防性乳房切除手术及预防性双侧输卵管卵巢切除术等来改善预后。国内专家认为保乳术后同侧残余乳腺组织和对侧乳腺组织仍有较高的乳腺癌发病风险，在术后给予充分辅助治疗及随访的前提下可进行保乳手术[22]。

BRCA1、BRCA2和非BRCA1/2致病变异携带者患对侧乳腺癌的年平均风险分别为4.0%、2.9%和1.9%。国内专家认为如果组织学分级、细胞增殖指数较高，且激素受体表达阴性，可以考虑对侧乳房预防性切除手术来提高患者预后[23]。

国内外专家一致认为预防性双侧乳腺切除术可以有效降低BRCA突变基因携带者乳腺癌复发的风险。由于我国患者群体BRCA基因突变数据不够完善、接受程度有限以及存在手术相关并发症的原因，在进行全面多学科评估，包括乳房检查、双侧钼靶和MRI检查等前提下，可以考虑此术式[24]。

携有BRCA1/2致病基因的乳腺癌患者行预防性双侧输卵管卵巢切除术可将健康突变携带者患卵巢癌的风险降低到1%～2%，总病死率降低到25%，提高总体存活率。绝经前妇女行预防性双侧输卵管卵巢切除术可以降低50%的乳腺癌风险，同时患对侧乳腺癌的风险可以降低30%～50%[25]。

9 总结

随着当前技术的进展，BRCA1/2检测越来越多在临床应用，在指导临床实践、进行遗传风险评估、抉择治疗方案和判断预后中起决策性作用。相信未来随着对BRCA1/2基因突变的认知加深及检测技术的进一步完善，BRCA基因检测结果的判定会越来越准确，可以更好地为精准医疗服务。