张 俊，柴 琳，赵若莲，刘荣均，李 萌，邹昱蕾

(云南中医药大学第三附属医院，云南 昆明 650011)

肺炎支原体(mycoplasma pneumonia，MP)是介于细菌和病毒之间能独立存活的最小病原微生物，通过呼吸道飞沫以气溶胶的形式传播。MP是引起儿童呼吸道感染的主要病原体，在儿童社区获得性肺炎中所占的比例逐年升高，MP的感染通常间隔3～7年会发生地方性流行和大流行[1-3]。MP感染引起的肺炎支原体肺炎(MPP)除引发呼吸系统疾病外，还可伴发多系统、多器官的损害[4]。随着抗生素使用引发的不良反应以及耐药现象的不断增加，严重影响了对MP感染的治疗。中医药在治疗MP感染方面显示了极大优势。本研究探讨生艾叶提取物对人肺炎支原体流行株、耐药株体外抑菌和杀菌的效果。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 中药原液的制备 中药原液的制备采用二次煮沸法。称取生艾叶100 g，加水1200 mL浸泡20 min，煮武火沸腾后文火煎30 min，搅拌过滤，药渣再加水800 mL后按上法再煎，过滤，两次药液合并浓缩成100 mL，用NaOH调pH值至7.6～7.8，取50 mL置离心管中离心10 min，4000 r/min；121 ℃高压蒸汽灭菌20 min 后，作为中药原液(1 mL药液相当于原药材1 g)，存放4 ℃冰箱贮存备用。实验前以MP液体培养基稀释。

1.1.2 MP工作菌液的制备 将冻干保存的肺炎支原体菌29342(Ⅰ型)、15531(Ⅱ型)和耐药菌株19号(昆明医学生物学研究所保藏)，用液体培养法传代。耐药菌株MP19是临床分离的MP菌株经药敏筛选，对依托红霉素、红霉素、阿奇霉素、克林霉素、克拉霉素、罗红霉素均耐药。

具体步骤：取冻干支原体菌种，从密封真空玻璃管中转接到SP-4液体培养基中，置于37 ℃温箱中孵育，每日定时观察2次，待颜色有变化时(预计孵育时间为5～7 d)，即培养基颜色由粉红色变为淡橙黄色澄清液体时，表明有肺炎支原体菌株生长。再次转接到SP-4液体培养基中，37 ℃培养5 d，即为MP2(第二代)。用SP-4液体培养法连续传代，取第三代，采用颜色变化单位(colour change units，CCU)方法测定MP浓度，用MP液体培养基稀释到104～105 CCU/mL，作为工作菌液。

1.1.3 培养皿制作 将培养皿原料混合，加入马血清、葡萄糖及抗生素(醋酸铊、青霉素、两性霉素、多粘菌素)，过滤除菌，在121 ℃下灭菌20 min，取出导入培养皿中约10 mL/个。

1.2 实验方法 将生艾叶中药原液倍比稀释成3个浓度，依次为：250 mg/mL、62.50 mg/mL、15.625 mg/mL；吸取生艾叶基础药液2 mL，加入2 mL含菌培养基入第一管，之后每次吸取上一管1 mL加3 mL含菌培养基入下一管内。完成后，吸取100 μL各浓度两次，分别注入相应编号的培养皿中，均匀涂在培养皿上，置电热恒温培养箱内37 ℃孵育0～48 h后观察结果。在显微镜下观察，随机计数两个视野记录菌落数，取平均值。

对照组设置：29342(Ⅰ型)、15531(Ⅱ型)和耐药菌株19号工作菌液，各吸取100 μL，注入培养皿中，均匀涂在培养皿上，置电热恒温培养箱内37 ℃孵育0～96 h后观察结果。在显微镜下观察，随机计数两个视野记录菌落数，取平均值。

1.3 统计学方法 所有实验数据的处理采用SPSS13.0软件，采用χ2检验，P<0.05差异有统计学意义。

2 结果

肺炎支原体流行株ATCC15531计数菌落总数2768个、ATCC29342计数菌落总数3040个，耐药株MP19计数菌落总数4136个。生艾叶粗提药液浓度250 mg/mL对人肺炎支原体(MP)流行株、耐药株体外在0、12、24 h 3个时间段均有杀菌作用，灭菌率在83～100%。生艾叶粗提药液浓度62.5 mg/mL在24 h对肺炎支原体流行株ATCC15531灭菌率为92%，对ATCC29342灭菌率为87%，对耐药株MP19灭菌率为94%。生艾叶提取物对人肺炎支原体MIC90 值在65～30 mg/mL，MIC50值在20～10 mg/mL。

表1 生艾叶在0小时混合时间不同浓度体外抗肺炎支原体灭菌率(%)比较

表2 生艾叶在12小时混合时间不同浓度体外抗肺炎支原体灭菌率(%)比较

表3 生艾叶在24 h混合时间不同浓度体外抗肺炎支原体灭菌率(%)比较

3 讨论

目前，国内外MP耐药现象严重，在世界范围内呈上升趋势。2000年Okazaki等[5]首次在儿童患者体内分离到对大环内酯类抗生素耐药的MP。随后国内外相继报道了在临床标本中尤其儿童患者中分离得到对大环内酯类抗生素耐药的MP。

中医认为肺炎支原体肺炎(MPP)属于温热病范畴中的“肺热喘咳”、“风温犯肺”等症，属于祖国医学“肺炎喘嗽”范畴。在中医辨证治疗中可以分为5个方向[6]：(1)宣肺止咳化痰，多数医家认为本病病机为肺气失宣，肺卫郁闭，痰浊壅阻，肺失肃降，以宣肺止咳化痰为主要治疗原则。(2)清热解毒，活血化瘀，肺热灼津为痰，痰热互结，阻于气道，气机不利，气滞而血瘀，故部分医家认为本病病机为痰热闭肺，瘀血阻络，从而确立清热解毒，活血化瘀的治疗原则。(3)养阴清热，小儿乃纯阳之体，具有发病容易，转变迅速的病理特点，感邪之后热变迅速，极易耗伤阴津，部分医家以此病机确立清热养阴的治疗原则。(4)清肺泻肝肺之肃降有制约肝火上升之效，外邪犯肺，肺失肃降可致肝火偏旺，木火刑金，故有医家采用清肺泻肝之法治疗本病。(5)扶正祛邪，MP感染后期由于久热久咳，耗伤肺之气阴，子病及母，伤及脾气，故以阴虚肺热、肺脾气虚型较为多见。此期主要以扶正祛邪为治疗原则。

艾叶为菊科(compositae)蒿属多年生草本植物艾(artemisia argyi Levl.et Vant.)的干燥叶，正式作为药物最早记载于梁·陶弘景《名医别录》[7]，具有“温经止血、散寒止痛”的作用。研究表明艾叶具有镇痛、抗菌消炎[8]、止血、抗病毒、平喘、免疫调节等活性。艾叶水提取物对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、白假丝酵母和黑曲霉均具有明显的杀菌作用[9-11]。艾叶挥发油也具有抑菌作用，其体外抑菌作用优于或等同于红霉素[6]。

通过实验研究，筛选出生艾叶提取物对本地人肺炎支原体流行株ATCC15531、ATCC29342和耐药株MP19直接抑菌杀菌最佳药物浓度在62.5 mg/mL，最佳时间是与肺炎支原体作用24 h，生艾叶提取物MIC90在65～30 mg/mL，MIC50在20～10 mg/mL。生艾叶对人肺炎支原体流行株ATCC15531、ATCC29342和耐药株MP19有直接抑菌杀菌的作用。

虽然MPP的发病机制尚未十分清楚，但免疫学机制一直是其研究重点，尤其是细胞因子在MP 感染中的作用越来越受到重视，其在许多疾病发生、发展中起到重要的作用，参与了MPP 的发病过程，艾叶免疫调节活性在免疫功能紊乱中也能起到一定的作用。中医中药对机体免疫的影响值得更深一步的研究。