虎恩熊，贾勇正，钱栋全，李伟建，孙芳芳

(云南润杰农业科技股份有限公司，云南 昆明 650000)

γ-聚谷氨酸(γ-PGA)是由D-/L-谷氨酸单体通过γ-酰胺键连接而成的一种直链纤维状生物大分子[1]，是一种具有生物可降解性、保湿性、高吸水性、成纤维性、生物相容性、可食用性和超强的吸附性等特性的不具毒性的新型天然高分子[2]，被广泛运用于食品、医药、环保、化妆品和农业等多个领域。目前γ-聚谷氨酸的生产制备主要采用微生物发酵法，在γ-聚谷氨酸发酵生产中，细菌中芽孢杆菌属类是应用最多的，其中以枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌为典型代表[3]。微生物发酵法生产γ-聚谷氨酸，发酵工艺和生产菌株是主要的影响因素，本文通过对实验室现有产γ-聚谷氨酸菌株的筛选和发酵条件优化，以期实现γ-聚谷氨酸高产量和高效率生产。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

化学试剂：蔗糖、葡萄糖、牛肉膏、蛋白胨、柠檬酸、甘油、酵母浸粉、谷氨酸钠、硫酸镁、氯化钠、氯化钙、磷酸氢二钾、硫酸锰、消泡剂、95%乙醇(除消泡剂外，其余化学试剂均为分析纯)。仪器：恒温摇床，无菌操作台，灭菌锅，恒温培养箱，电子天平，50 L 发酵罐，紫外分光光度计。

1.2 培养基与培养条件

1.2.1 培养基

平板培养基：蛋白胨0.8%，牛肉膏0.3%，氯化钠0.5%，葡萄糖0.25%，琼脂1.6%，自然pH；灭菌条件：121 ℃，20 min。

种子培养基：葡萄糖1%，蛋白胨1%，谷氨酸钠2%，硫酸镁0.1%，氯化钠0.5%，磷酸氢二钾0.05%，pH7.0；灭菌条件：121 ℃，20 min。

初始发酵培养基：蔗糖3.5%，蛋白胨2%，谷氨酸钠4%，硫酸镁0.1%，氯化钠0.5%，氯化钙0.01%，磷酸氢二钾0.05%，硫酸锰0.02%，消泡剂1%，pH7.0；灭菌条件：121 ℃，20 min。

1.2.2 培养方法

平板活化培养：在无菌条件下，挑取一环保存于 -4 ℃ 冰箱的枯草芽孢杆菌株种接种于平板培养基中，37 ℃ 恒温培养12～14 h，作为一次活化菌种。将一次活化菌种接种于新鲜平板培养基中，37 ℃ 下静置培养12～14 h，作为二次活化菌种。

种子培养：在无菌条件下，挑取平板培养好的二次活化菌种接种于摇瓶种子培养基上，置于摇床上 200 r/min，37 ℃ 恒温培养约12～14 h，待OD600大于8时取出为种子液备用。

发酵培养：以3%的接种量将种子培养液接种到 250 mL 三角瓶中，按照发酵液初始pH7.0，发酵转速 200 r/min，发酵温度 37 ℃，装液量60%即 150 mL 进行恒温培养 72 h。

1.3 高产γ-聚谷氨酸菌株筛选

挑选实验室现有的8株产γ-聚谷氨酸菌株，分别接种于平板培养基活化后，在无菌条件下接种至种子摇瓶上，待OD600值大于8时接种至发酵摇瓶上进行发酵培养，37 ℃ 恒温培养 72 h 后测定γ-聚谷氨酸产量，对比得到聚谷氨酸产量最高的菌株HG-02，其最终产量为 21.3 g/L。菌株HG-02经 16 s rDNA鉴定为枯草芽孢杆菌，为谷氨酸依赖性菌株。

聚谷氨酸质量浓度采用酒精法测量：取 10 mL 发酵液，10000 r/min 离心 30 min，去除菌体。加入3倍体积的95%乙醇，充分搅拌待聚谷氨酸析出后，加入蒸馏水进行重溶，再加入3倍体积的95%乙醇析出聚谷氨酸，反复溶3次后，将聚谷氨酸置于 50 ℃ 烘干至恒重，得到聚谷氨酸质量浓度。

1.4 单因素试验优化初始发酵培养基

1.4.1 氮源种类与质量浓度筛选

以初始发酵培养基为基础，分别设置不同的氮源：牛肉膏、蛋白胨、酵母浸粉，其它条件相同，通过发酵培养测定聚谷氨酸质量浓度获得最佳氮源。再设置最佳氮源的添加量分别为 30 g/L，35 g/L，40 g/L，45 g/L，50 g/L。每个试验组设置3个平行，37 ℃ 恒温培养 72 h 后，测定发酵液中聚谷氨酸质量浓度。

1.4.2 碳源种类与质量浓度筛选

以初始发酵培养基为基础，分别设置不同的碳源：蔗糖、葡萄糖、柠檬酸，其它条件相同，通过发酵培养测定聚谷氨酸质量浓度获得最佳碳源。再设置最佳碳源的质量浓度分别为 20 g/L，25 g/L，30 g/L，40 g/L，45 g/L。每个试验组设置3个平行，37 ℃ 恒温培养 72 h 后，测定发酵液中聚谷氨酸质量浓度。

1.4.3 谷氨酸钠添加量筛选

对于谷氨酸依赖型菌株，发酵培养基中必须有谷氨酸存在才能合成聚谷氨酸，如果培养基中没有谷氨酸，则不能合成聚谷氨酸[4]。谷氨酸钠的质量浓度就显得非常重要，设置质量浓度分别为 30 g/L，40 g/L，50 g/L，60 g/L，70 g/L。每个试验组设置3个平行，37 ℃ 恒温培养 72 h 后，测定发酵液中聚谷氨酸质量浓度。

1.5 单因素试验优化发酵工艺

1.5.1 摇瓶转速筛选

发酵培养基的转速影响发酵体系的物质传递、氧气传递[5]。为探寻发酵中最佳摇瓶转速，分别设置转速为 160 r/min，180 r/min，200 r/min，220 r/min，240 r/min。每个试验组设置3个平行，37 ℃ 恒温培养 72 h 后，测定发酵液中聚谷氨酸质量浓度。

1.5.2 接种量筛选

接种量影响发酵液中菌体的富集速度和含量，从而影响产物的积累。为探寻发酵中最佳接种量，分别设置接种量为3%，4%，5%，6%，7%。每个试验组设置3个平行，37 ℃ 恒温培养 72 h 后，测定发酵液中聚谷氨酸质量浓度。

1.5.3 初始pH值筛选

pH对微生物的生长和代谢产物生成都有很大影响,不同的微生物对pH值的要求是不同的，为探寻发酵中最佳初始pH值，分别设置初始pH值为6.4，6.6，6.8，7.0，7.2。每个试验组设置3个平行，37 ℃ 恒温培养 72 h 后，测定发酵液中聚谷氨酸质量浓度产量。

1.5.4 发酵温度筛选

从酶反应动力学来看，温度升高，反应速度加大，生长代谢加快，产物生成提前。但是，温度越高酶失活越快，菌体易于衰老，影响产物的生成。为探寻发酵过程中的最佳温度，分别设置发酵温度为 32 ℃，34 ℃，36 ℃，38 ℃，40 ℃。每个试验组设置3个平行，37 ℃ 恒温培养 72 h 后，测定发酵液中聚谷氨酸质量浓度。

1.5.5 发酵时间筛选

发酵时间的长短直接关系到产物的积累，为探寻最佳发酵时间，分别设置发酵时间为 24 h，36 h，48 h，60 h，72 h。每个试验组设置3个平行，37 ℃ 恒温培养 72 h 后，测定发酵液中聚谷氨酸质量浓度。

1.5.6 装液量筛选

装液量影响发酵液的溶氧，为探寻最佳发酵装液量，分别设置装液量为20%，30%，40%，50%，60%。每个试验组设置3个平行，37 ℃ 恒温培养 72 h 后，测定发酵液中聚谷氨酸质量浓度。

1.6 正交试验优化发酵条件

根据单因素实验情况，选择培养基及含量、发酵温度、初始发酵pH、接种量、装液量等来确定最优的发酵条件。正交试验表根据实际情况选择，每组试验设置3个平行，通过测定最终γ-聚谷氨酸质量浓度确定最佳发酵条件。

1.7 小试发酵

根据单因素试验和正交试验结果进行 50 L 罐子小试发酵试验，验证优化后的发酵条件。种子液接种方法为火焰接种法，从发酵开始每隔 2 h 记录pH和溶氧的变化，同时发酵 12 h 后每隔 2 h 取样测量γ-聚谷氨酸质量浓度直至发酵结束。

2 结果与讨论

2.1 单因素试验优化培养基成分

采用 250 mL 三角瓶进行单因素优化发酵试验，按照发酵初始pH7.0，发酵转速 200 r/min，发酵温度 37 ℃，装液量 150 mL，接种量4%进行培养，发酵时间 48 h，发酵完成后检测发酵终点发酵液中的γ-聚谷氨酸质量浓度，按γ-聚谷氨酸质量浓度来确定培养基最优成分及用量。发酵试验结果如图1，图2，图3，图4，图5所示。

图1 不同氮源对γ-聚谷氨酸质量浓度的影响

图2 不同碳源对γ-聚谷氨酸质量浓度的影响

图3 蔗糖含量对γ-聚谷氨酸质量浓度的影响

图4 蛋白胨含量对γ-聚谷氨酸质量浓度的影响

图5 谷氨酸钠含量对γ-聚谷氨酸质量浓度的影响

由图可知，菌株HG-02发酵生产γ-聚谷氨酸的最佳碳源为蔗糖，最佳氮源为蛋白胨，其中蔗糖最佳质量浓度为 40 g/L，蛋白胨最佳质量浓度为 35 g/L，谷氨酸钠最佳质量浓度为 50 g/L。

2.2 单因素试验优化发酵工艺

采用 250 mL 三角瓶进行单因素优化发酵试验，按照单因素优化的培养基配方蔗糖4%，蛋白胨4%，谷氨酸钠5%，硫酸镁0.1%，氯化钠0.5%，氯化钙0.01%，磷酸氢二钾0.05%，硫酸锰0.02%来进行发酵，发酵完成后检测发酵终点发酵液中的γ-聚谷氨酸质量浓度，按γ-聚谷氨酸质量浓度来确定培养基最优成分及用量。发酵试验结果如图6，图7，图8，图9，图10，图11所示。

图6 摇瓶转速对γ-聚谷氨酸质量浓度的影响

图7 接种量对γ-聚谷氨酸质量浓度的影响

图8 初始pH对γ-聚谷氨酸质量浓度的影响

图9 温度对γ-聚谷氨酸质量浓度的影响

图10 发酵时间对γ-聚谷氨酸质量浓度的影响

图11 装液量对γ-聚谷氨酸质量浓度的影响

由图可知，菌株HG-02发酵生产γ-聚谷氨酸的最佳转速为 220 r/min，最佳接种量为6%，最佳初始pH为6.8，最佳发酵温度为 36 ℃，最佳发酵时间为 48 h，最佳装液量为40%。

2.3 正交试验优化发酵条件

根据以上单因素实验情况，选择发酵温度、谷氨酸钠、蔗糖、发酵温度进行正交试验来确定最优的发酵条件，正交设计表及结果如表2所示，各因素水平如表1所示。

从正交试验结果表可知，影响γ-聚谷氨酸产率的因素顺序为B>A>D>C，即谷氨酸钠>蔗糖>发酵温度>初始pH，选择最优的组合为A2B3C3D3，即：谷氨酸钠 60 g/L,蔗糖 40 g/L,初始pH值7.0，发酵温度 37 ℃。根据此条件进行摇瓶发酵，至 48 h 发酵结束，测定γ-聚谷氨酸含量为 34.2 g/L。

表1 正交试验各因素水平

表2 正交试验设计表及结果

2.4 小试发酵

在无菌条件下，用接种针挑取一环在平板上活化的菌体接种至种子摇瓶种中，放置于 37 ℃ 恒温摇床上，设置转速为 220 r/min，培养12～14 h，待菌液OD600大于 8 h，接种至 50 L 发酵罐上。发酵罐空消 121 ℃ 灭菌 20 min，实消 121 ℃ 灭菌 30 min，装液量为 20 L(实消后体积为 21.5 L)，初始pH为7.01(实消后pH为6.86)，接种量为6%，搅拌转速为 220 r/min，通风量为 1.6 m3/h，罐压为 0.07 Mpa，37 ℃ 恒温培养。发酵结束后，测量聚谷氨酸最高质量浓度为 35.9 g/L。发酵过程中的pH、溶氧及聚谷氨酸质量浓度变化如图12所示。

图12 小试发酵pH、溶氧及聚谷氨酸质量浓度变化

3 小结

从实验室现有产γ-聚谷氨酸菌株中筛选出一株高产菌株HG-02，经16srDNA鉴定为枯草芽孢杆菌。以初始培养基为基础，通过单因素试验和正交试验获得菌株HG-02产γ-聚谷氨酸的最佳发酵培养基配方和工艺：蔗糖4%，蛋白胨3.5%，谷氨酸钠6%，硫酸镁0.1%，氯化钠0.5%，氯化钙0.01%，磷酸氢二钾0.05%，硫酸锰0.02%，初始pH7.0，121 ℃ 灭菌 30 min，250 mL 三角瓶，装液量40%即 100 mL，接种量6%，摇床转速为 220 r/min，37 ℃ 振荡培养 48 h。最后用 50 L 小试发酵试验验证，测得聚谷氨酸最终质量浓度为 35.9 g/L，相较于初始发酵工艺产量提高了68.5%，后续将继续进行放大试验。