李梦媛，李小黎，薛 冰，张乃文，鲁丽华，张 婧，刁华琼，陈 琳

(1.北京中医药大学第三附属医院，北京 100029；2.首都医科大学，北京 100029)

女性在中年期由于体内雌激素水平减少导致机体出现一系列以躯体、精神症状为主的围绝经期表现，平素工作压力大、社会家庭关系不和谐等因素的刺激，更易导致女性围绝经期抑郁症的发生[1]。该病以情绪低落、焦虑忧郁等症状为主，伴有潮热盗汗、烦躁不安、记忆力下降等表现。研究[2]显示，围绝经期抑郁女性在心理健康、生活质量方面比同期女性更差。研究[3-6]表明，雌激素撤退可导致海马神经细胞再生障碍，下丘脑-垂体-卵巢(hypothalamus-pituitary-ovary,HPO)轴、下丘脑-垂体-肾上腺(hypothalamus-pituitary-adrenal, HPA)轴功能异常和单胺类神经递质缺乏，从而引起围绝经期抑郁的发生。临床多采用激素及抗抑郁类药物治疗[7]，虽见效快，但存在不良反应大、复发率高等问题，而中医辨证论治对该病的治疗有独特的优势[8]。柴坤解郁汤是治疗围绝经期抑郁的临床经验方。本研究从去势应激模型大鼠行为学变化、HPO轴激素水平变化以及下丘脑雌激素受体α(estrogen receptor alpha,ERα)水平变化方面，探究柴坤解郁汤改善围绝经期抑郁的作用机制。

1 材料

1.1 动物 SPF级健康雌性SD大鼠，体质量(190±20)g，共60只。购自北京维通利华实验动物技术有限公司[动物生产许可证号为SCXK(京)2012-0001]，饲养于首都医科大学动物实验室。本实验经首都医科大学动物伦理委员会批准，伦理审查编号为AEEI-2021-218。

1.2 药物及试剂 柴坤解郁汤(益母草24 g,刺五加、乌梅、浮小麦各18 g,合欢花、巴戟天各12 g,柴胡、郁金、栀子各9 g)，购自北京中医药大学第三附属医院，并制成颗粒剂；盐酸氟西汀胶囊(H20073985)：山西仟源医药集团股份有限公司；大鼠卵泡刺激素(follicle-stimulating hormone，FSH)/黄体生成素(luteinizing hormone，LH)/雌二醇(estradiol,E2)酶联免疫吸附试验试剂盒(E-EL-R0391c/E-EL-R0026c/E-EL-0152c)：武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司；抗雌激素受体α(estrogen receptor alpha,ERα)抗体(1325)：美国细胞信号技术公司；抗GAPDH抗体(ab9485)、辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG二抗(ab7090)：英国艾博抗；Tris-glycine-SDS电泳缓冲液(AR0139)、SDS-PAGE凝胶制备试剂盒(AR0138)、Trizol试剂(FTR-50)：北京赛百盛；反转录试剂盒(QP056)：GeneCopeia；2×SYBR Green qPCR反应混合液(无ROX)(MPC2107026)：武汉赛维尔生物科技有限公司。

1.3 仪器 5415D型离心机：德国Eppendorf公司；酶标分析仪：北京普朗新技术有限公司；LabWorksTM凝胶成像及分析系统：美国UVP公司；iQ5 Real-time PCR扩增仪：美国Applied Biosystems公司；旷场试验敞箱及数据分析、强迫游泳试验装置：首都医科大学行为学平台实验室。

2 方法

2.1 围绝经期抑郁大鼠模型复制、分组及给药 将SD大鼠适应性喂养1周后，将其随机分为假手术组，模型组，柴坤解郁汤低、中、高剂量组和盐酸氟西汀组，每组10只。参照文献[9-10]的方法及本实验室前期预实验结果，采用去势手术联合慢性不可预知性温和刺激(chronic unpredictable mild stimulation,CUMS)两步法复制围绝经期抑郁模型。①去势手术。用1.5%戊巴比妥钠5 mL/kg对大鼠进行麻醉，在背部肋弓下1 cm与脊柱侧面1 cm相交处，剪开切口，用镊子找出一团被脂肪组织包裹的粉红色菜花状卵巢，在近子宫角位置进行结扎，切除双侧卵巢。假手术组仅切除卵巢周围少量脂肪,术后无需特殊护理。②CUMS。术后第8天，对摘除卵巢的模型组大鼠开始进行CUMS处理，假手术组正常饲养。每天随机给予2种不同刺激，持续21 d。同种刺激再次出现的间隔周期为4 d以上。刺激方法：鼠笼倾斜24 h(将鼠笼倾斜至45°)；拥挤鼠笼24 h；持续光照24 h；禁食24 h；禁水24 h；4 ℃冷水中5 min；单笼饲养24 h；束缚(束缚盒束缚四肢限制活动)3 h；潮湿垫料24 h；夹尾3 min。以糖水偏爱率降低、强迫游泳不动时间增加等指标[11-12]判断模型是否复制成功。参照课题组前期实验有效药量[13]，按照成人用量7倍计算大鼠灌胃量，柴坤解郁汤低、中、高剂量组给药剂量分别为0.9、1.8、3.6 g/kg，分别相当于成人临床用量的3.5、7、14倍，以10 mL/kg生理盐水配置颗粒剂，3组浓度分别为0.11、0.22、0.44 g/mL，盐酸氟西汀组给药剂量为2.33 mg/kg，灌胃浓度为0.70 g/mL。假手术组和模型组予以等容积生理盐水。以上灌胃均每日1次，从应激开始到实验结束，持续21 d。

2.2 行为学观察

2.2.1 蔗糖水偏好试验 蔗糖水偏好试验主要测试大鼠快感是否缺失，而快感缺失是衡量抑郁症状的重要标准。模型复制第21天，12 h禁食禁水后，将大鼠单笼放置，给每个笼子两瓶同样容积的液体(一瓶为1%蔗糖水，一瓶为纯水)，4 h后取走两个瓶子并称质量。大鼠蔗糖水偏爱率=糖水消耗量/(糖水消耗量+纯水消耗量)×100%。

2.2.2 旷场试验 模型复制第21天，将大鼠放入100 cm×100 cm×40 cm的旷场反应箱内底面正中心，进行摄像和计时，观察并记录每只大鼠在5 min内所有活动距离及进入中心区域的活动距离。实验时保持安静，采用Super Maze视频记录分析软件(上海欣软信息科技有限公司)记录旷场试验结果。

2.2.3 强迫游泳试验 模型复制第21天，在室温下将大鼠置入水深约37 cm的温水中，强迫大鼠游泳6 min，记录后4 min 内大鼠静止不动时间，表现为大鼠仅有头部露出水面，身体呈现飘浮状态，四肢可有微动但不挣扎。

2.3 ELISA法检测大鼠血清FSH、LH、E2水平 从大鼠腹主动脉取血，静置30 min后，3 500 r/min离心10 min，分离血清，放置于-80 ℃冰箱中保存，采用ELISA试剂盒测定血清FSH、LH、E2水平。

2.4 Western blot法检测大鼠下丘脑ERα蛋白表达水平 取大鼠下丘脑组织，提取总蛋白，蛋白定量后配制SDS-PAGE凝胶，于4 ℃转膜缓冲液中350 mA恒电流转膜2 h，将膜按蛋白的印迹位置剪开，置于含ERα一抗(1∶1 000)的Blotto中，摇动漂洗后，放入对应二抗(1∶8 000)的Blotto中，将膜置于曝光盒中，对感光胶片进行曝光后进行显影、定影处理，分析各组蛋白条带的亮度值。

2.5 Rt-PCR法检测大鼠下丘脑ERα mRNA表达水平 将上述-80 ℃冰箱中储存的脑组织，加入1 mL Trizol研磨，按说明书步骤提取RNA，加入20 μL DEPC水溶解混匀，分别留取1 μL用于定量和电泳，其余RNA置-80 ℃保存。按照反转录反应说明书将RNA反转录，得到cDNA。每个反转录产物均在PCR仪上进行扩增。ERα正向引物：5′-CATTATGGGGTCTGGTCCTGCG-3′；ERα反向引物：5′-GCCCACTTCGTAACACTTGC-3′。GAPDH正向引物：5′-TGCTGAGTATGTCGTGGAG-3′；GAPDH反向引物：5′-GTCTTCTGAGTGGCAGTGAT-3′。循环温度和时间：95 ℃，30 s；95 ℃，15 s；60 ℃，30 s。共40个循环。最后进行数据处理分析。

3 结果

3.1 6组大鼠蔗糖水偏好率、旷场试验结果、强迫游泳不动时间比较 与假手术组比较，模型组大鼠蔗糖水偏好率、旷场总路程、旷场中心区域路程显著降低(P<0.05)，强迫游泳不动时间显著延长(P<0.05)。与模型组比较，柴坤解郁汤中、高剂量组及盐酸氟西汀组蔗糖水偏好率，旷场总路程、旷场中心区域路程显著升高(P<0.05)，柴坤解郁汤高剂量组、盐酸氟西汀组强迫游泳不动时间显著缩短(P<0.05)。柴坤解郁汤中、高剂量组和盐酸氟西汀组蔗糖水偏好率、旷场总路程和旷场中心区域路程显著大于柴坤解郁汤低剂量组(P<0.05)。见表1。

表1 6组大鼠蔗糖水偏好率、旷场试验结果、强迫游泳不动时间比较

3.2 6组大鼠血清FSH、LH、E2水平及下丘脑ERα蛋白和mRNA表达水平比较 与假手术组比较，模型组大鼠血清FSH、LH水平显著升高(P<0.05)，血清E2水平及下丘脑ERα蛋白和ERα mRNA表达水平显著降低(P<0.05)。与模型组比较，柴坤解郁汤中、高剂量组与盐酸氟西汀组FSH、LH水平显著降低(P<0.05)，E2水平及下丘脑ERα蛋白和其mRNA表达水平显著升高(P<0.05)。柴坤解郁汤中、高剂量组和盐酸氟西汀组血清FSH、LH水平显著低于柴坤解郁汤低剂量组(P<0.05)，血清E2水平和下丘脑ERα表达水平显著高于柴坤解郁汤低剂量组(P<0.05)；柴坤解郁汤中剂量组E2水平显著高于盐酸氟西汀组(P<0.05)。见表2和图1。

表2 6组大鼠血清FSH、LH、E2含量及下丘脑ERα蛋白和mRNA表达水平比较

注：A.假手术组；B.模型组；C.柴坤解郁汤低剂量组；D.柴坤解郁汤中剂量组；E.柴坤解郁汤高剂量组；F.盐酸氟西汀组

4 讨论

相关调查[14]显示，在世界范围内围绝经期抑郁发病率约为25%，这一疾病已经严重影响中年女性的生活质量。目前，抑郁症动物模型主要有脂多糖腹腔注射模型、嗅球摘除模型、基因模型、CUMS模型等[15]。考虑到模型稳定性及实验可操作性，本研究采用CUMS联合去势手术复制围绝经期抑郁动物模型。

围绝经期抑郁属于中医学“绝经前后诸症”“郁证”等范畴，其发生与肝肾两脏功能失调密不可分。女子“七七，任脉虚，太冲脉衰少，天癸竭，地道不通，故形坏而无子”(《素问·上古天真论》)。围绝经期妇女天癸渐竭，肾气渐衰，精血不足，冲任空虚，再加上女性平素易受七情所伤，常忧思多虑，致肝气失疏，气机郁结不畅，从而易发展为本病。《景岳全书》：“情志之郁，总由乎心，此因郁而病也。”因此，围绝经期抑郁的基本病机为肾虚肝郁[16]。柴坤解郁汤是临床经验方，对肾虚肝郁型围绝经期抑郁的疗效显著。本方以柴胡和刺五加为君，活血祛瘀、补肾益气、安神益智；臣药益母草活血散瘀调经，为妇科圣药；佐以浮小麦、乌梅养心安神、清虚热、敛阴止汗，合欢花安神解郁、养血宁心，郁金既能活血也能行气，有凉血清心、解郁行气之功，巴戟天补肾益精，配以少量栀子以清气分郁热、凉血除烦。全方标本兼治，配伍合理，共奏补益肾精、疏肝解郁、养心安神之功。

行为学试验结果显示，与假手术组比较，模型组大鼠蔗糖水偏好率、旷场总路程、旷场中心区域路程均显著降低，强迫游泳不动时间明显增加，表明模型组大鼠对新异环境的探索行为和自主行为减少，对美好事物的欣快感降低，遇到危险的绝望度增加，说明围绝经期抑郁模型大鼠处于应激状态。与模型组大鼠比较，柴坤解郁汤中、高剂量组大鼠蔗糖水偏好率、旷场总路程、旷场中心区域路程均显著升高，提示柴坤解郁汤能够有效改善围绝经期抑郁大鼠应激状态。

研究[17]表明，围绝经期系列症状主要是由卵巢功能退行性改变，机体雌激素水平明显波动或下降，导致HPO轴失衡引起的。HPO轴是调节女性生理现象的神经-内分泌系统，主要是由下丘脑弓状核和室旁核脉冲式分泌促性腺激素释放激素，再通过门脉系统的微血管传递至垂体前叶，刺激垂体释放FSH和LH，LH和FSH再促进卵巢分泌E2[18]。临床研究[19]表明，围绝经期抑郁患者血清E2水平低于围绝经期无症状者，但FSH、LH等激素水平显著升高，说明HPO轴激素水平波动与围绝经期抑郁的发病密切相关。本研究结果显示，模型组E2水平显著低于假手术组，而FSH、LH水平明显高于假手术组；治疗后柴坤解郁汤中、高剂量组E2水平明显升高，FSH、LH水平明显降低，且柴坤解郁汤中剂量组E2水平显著高于柴坤解郁汤高剂量组和盐酸氟西汀组，说明柴坤解郁汤可能通过提高E2水平影响HPO轴激素水平变化，从而发挥改善围绝经期抑郁的作用。非孕妇女体内雌激素除了卵巢合成分泌之外，还可以通过肾上腺皮质及周围脂肪组织、肝脏等芳香化途径转化而成。盐酸氟西汀干预后模型大鼠血清E2水平的恢复可能是其对肾上腺皮质的激发作用所致[20]。

雌激素通过与雌激素受体结合发挥抗抑郁作用，主要通过ERα和ERβ这两种ER亚型作用于细胞。研究[21]表明，ER激动剂可发挥抗抑郁样作用，反之，雌激素受体拮抗剂则会阻断雌激素的抗抑郁作用。围绝经期不仅雌激素水平下降明显，神经系统、免疫组织或心脑血管系统中雌激素受体表达水平也发生变化[22]。ERα在下丘脑、垂体细胞及免疫细胞的生长、存活和应答中起到关键作用，是介导雌激素信号转导通路的重要蛋白。研究[23]发现，大约40%的ERα结构与下丘脑室旁核释放的促肾上腺皮质激素释放激素(corticotropin-releasing hormone，CRH)相似，并且发现雌激素反应元件存在于CRH启动子区，说明雌激素可能通过ERα及CRH神经细胞共区域化直接影响CRH水平，进而影响HPA轴，导致抑郁发生。下丘脑作为神经内分泌调节的中枢系统，是维持机体内环境稳定的重要部分。本研究结果表明，与假手术组比较，模型组大鼠下丘脑ERα表达水平显著下降；与模型组比较，柴坤解郁汤中、高剂量组和盐酸氟西汀组下丘脑ERα表达水平显著升高；柴坤解郁汤中、高剂量组下丘脑ERα表达水平较接近于假手术组。结果表明，柴坤解郁汤可增加模型大鼠下丘脑ERα的表达水平，可能是该方通过提高体内雌激素水平，影响HPO轴激素变化，从而提高下丘脑ERα水平，以此增强雌激素的生物学效应。

综上所述，柴坤解郁汤可以有效预防并改善围绝经期抑郁大鼠的应激状态，其作用机制与其影响HPO轴激素水平以及调节下丘脑ERα表达水平有关。