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化瘀通络灸对血管性痴呆大鼠髓鞘再生相关蛋白表达的影响

2023-02-13王维顺樊吟秋查必祥张雅婷

安徽中医药大学学报 2023年1期
关键词:胼胝髓鞘化瘀

王维顺,杨 骏,樊吟秋,王 萍,查必祥,孔 钰,张雅婷

(1.安徽中医药大学研究生院,安徽 合肥 230012;2.安徽中医药大学第一附属医院,安徽 合肥 230031)

血管性痴呆(vascular dementia,VD)是指由缺血性、出血性卒中等血管性脑损伤疾病所产生的认知障碍综合征,其临床表现以记忆、行为和认知功能缺损为主[1]。VD是仅次于阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)的常见痴呆类型[2],约占所有痴呆病例的15%~20%[3]。VD目前尚无有效的治疗手段,而艾灸可改善VD认知障碍,促进脑内神经新生和VD后神经干细胞(neural stem cells,NSCs)的增殖、迁移、分化[4]。研究[5]表明,VD的病理特征除灰质损伤外,还包括白质损伤和髓鞘缺失。但既往研究主要着眼于脑灰质及构成灰质主体的神经细胞,针灸对VD后脑白质功能的影响鲜有报道。实际上除了大脑灰质会发生缺血、低氧损伤外,大脑白质亦对缺血、低氧敏感,因此脑白质的脱髓鞘病变被认为是VD的发病机制之一[6]。

化瘀通络灸是治疗脑血管病的有效方法,前期的临床研究和基础实验[7-8]均证实了化瘀通络灸治疗VD的疗效。本实验观察化瘀通络灸对VD大鼠髓鞘再生相关蛋白表达的影响,探讨化瘀通络灸治疗VD的可能作用机制。

1 材料

1.1 动物 选用SPF级健康成年雄性Wistar大鼠60只,由济南朋悦实验动物繁育有限公司[生产许可证号:SCXK(鲁)2019-0003]提供,体质量(250±20)g。统一饲养于安徽中医药大学针灸经络研究所普通级动物房。饲养条件:恒温(25±1)℃,湿度(50±10)%。实验获得安徽中医药大学实验动物伦理委员会批准,伦理审批号:AHUCM-rats-2022034。

1.2 试剂 氯马斯汀(批号 C129211):阿拉丁;髓鞘碱性蛋白(myelin basic protein,MBP)一抗(批号 bs-0258R)、髓鞘相关糖蛋白(myelin associated glycoprotein,MAG)一抗(批号 bs-0380R):北京Bioss公司;Alexa Fluor 488标记山羊抗兔IgG(H+L)(批号 A0423):上海碧云天生物技术有限公司;羊抗兔HRP标记二抗(批号 L3012):美国SAB公司。

1.3 仪器 Morris水迷宫:北京众实迪创科技发展有限公司;RM2016病理切片机:德国Leica;全自动数字扫描仪:匈牙利3DHISTECH公司;垂直电泳仪:美国Bio-Rad公司。

2 方法

2.1 模型复制与分组 将大鼠饲养1周后,使用Morris水迷宫实验筛除原地旋转、漂浮不动和特别灵敏的大鼠,将余下55只纳入实验。采用随机数字表法将12只大鼠随机选为假手术组,其余大鼠用于复制VD模型。采用双侧颈总动脉永久结扎法复制VD大鼠模型[9]。术前大鼠禁水、禁食8 h,3%戊巴比妥钠(30 mg/kg)腹腔注射麻醉,浅反射消失后,将大鼠固定在特制鼠板上,无菌操作,在大鼠颈部正中作纵向切口,用镊子钝性分离一侧颈总动脉,避免触碰神经,动脉夹夹闭右侧颈总动脉10 min,松开10 min,夹闭、松开反复操作3次,用4-0号外科缝线分别在动脉近心端及远心端永久结扎,从中间剪断动脉,缝合伤口,分开放回笼中饲养。1周后再以相同方法处理左侧颈总动脉。假手术组按上述操作,分离颈总动脉后不作其他处理。模型复制3 d后,用水迷宫对大鼠进行模型鉴定。将假手术组大鼠定位航行实验第4天逃避潜伏期的平均值作为参考值,再将模型复制后的每只大鼠第4天的平均逃避潜伏期减去参考值,所得差值与该鼠的平均逃避潜伏期相除得一比值,若比值超过20%,则表明模型复制成功[10]。筛选模型成功的VD大鼠36只,随机分为艾灸组、西药组、模型组,每组12只。

2.2 各组干预方法 艾灸组大鼠参照《实验动物常用穴位名称与定位》[11]选取“大椎”“百会”“神庭”穴进行艾灸,将大鼠固定于自制的灸架上,点燃清艾条(5 mm×12 cm,江苏康美制药有限公司),于相应穴位上1~2 cm处进行悬灸,每天20 min,7 d为1个疗程,共干预3个疗程。西药组大鼠用氯马斯汀(H1受体拮抗剂)与蒸馏水配置灌胃溶液,按10 mL/kg灌胃,每日2次,7 d为1个疗程,共干预3个疗程。仅将假手术组和模型组大鼠放于灸架上,不作其他任何处理,干预时间同艾灸组。

2.3 观察指标及方法

2.3.1 定位航行实验 Morris水迷宫为大鼠通用型泳池,避光,控制水温为(23±2)℃。沿水池周长等距分布,水池区域被划分为4个象限,透明圆形平台放在第3象限中间位置水下2 cm。将大鼠分别从4个象限放入水中,其逃避潜伏期为2 min内找到平台的时间。2 min内仍未找到平台的大鼠,将此次入水逃避潜伏期记录为2 min,然后将大鼠引导到平台上,停留30 s。连续训练4 d,确保大鼠每天实验时间相同,每次入水时位置相同。

2.3.2 免疫荧光染色法检测大鼠胼胝体区MAG、MBP阳性细胞表达水平 治疗结束24 h内,每组各取6只大鼠灌注4%多聚甲醛后取脑,将大脑组织用石蜡包埋后切片。切片使用0.01 mmol/L PBS漂洗,羊血清封闭,加入一抗MAG、MBP(1∶200),4 ℃过夜,二抗使用Alexa Fluor 488标记山羊抗兔IgG(H+L)(1∶500),DAPI复染细胞核。阴性对照采用PBS代替一抗,其余步骤不变。用全自动数字扫描仪扫描整个脑片区域,重点观察胼胝体区MAG、MBP的表达水平。

2.3.3 Western blot法检测大鼠胼胝体区MAG、MBP表达水平 取剩余6只大鼠断头后取脑,冰上提取胼胝体,-80 ℃保存。裂解液提取组织总蛋白后,经上样、电泳、转膜等过程,分别加入一抗MBP(1∶1 000)、MAG(1∶1 000),4 ℃孵育摇床过夜。加入羊抗兔HRP标记二抗(1∶5 000),再使用ECL化学发光液显影,放入成像系统中扫描,使用Image J软件读取灰度值。

3 结果

3.1 各组大鼠Morris水迷宫逃避潜伏期比较 模型复制3 d后,用水迷宫对大鼠进行模型鉴定,假手术组大鼠(n=12)逃避潜伏期为(11.06±3.23)s,VD模型大鼠(n=36)逃避潜伏期为(66.58±31.76)s,两组大鼠逃避潜伏期比较,差异有统计学意义(P<0.05),说明VD大鼠模型制备成功。

与假手术组比较,干预后模型组逃避潜伏期延长(P<0.05);与模型组比较,艾灸组、西药组逃避潜伏期均显著缩短(P<0.05)。见图1。

注:与假手术组比较,*P<0.05;与模型组比较,#P<0.05

3.2 各组大鼠胼胝体区MAG、MBP阳性细胞表达水平比较 胼胝体区MAG、MBP染色为丝状。与假手术组比较,模型组胼胝体区MAG、MBP平均荧光强度均降低(P<0.05);与模型组比较,艾灸组MAG、MBP平均荧光强度增强(P<0.05);与西药组比较,艾灸组MAG平均荧光强度增强(P<0.05),MBP平均荧光强度差异无统计学意义(P>0.05)。见图2。

注:A.假手术组;B.模型组;C.艾灸组;D.西药组;与假手术组比较,*P<0.05;与模型组比较,#P<0.05;与西药组比较,△P<0.05

3.3 各组大鼠胼胝体区MAG、MBP表达水平比较 与假手术组比较,模型组胼胝体区MAG、MBP表达水平下降(P<0.05);与模型组比较,艾灸组MAG、MBP表达水平增加(P<0.05);与西药组比较,艾灸组MAG表达水平增加(P<0.05),MBP表达水平组间差异无统计学意义(P>0.05)。见图3。

注:A.假手术组;B.模型组;C.艾灸组;D.西药组;与假手术组比较,*P<0.05;与模型组比较,#P<0.05;与西药组比较,△P<0.05

4 讨论

VD属于中医学“呆病”范畴,年老肾精不足,气血亏虚,血脉瘀滞,脑络瘀阻,日久可导致脑失所养、髓脑空虚,发为本病,故血瘀与VD密切相关。化瘀通络灸取督脉百会、大椎、神庭穴,发挥艾灸温阳通脉、活血散结的作用,以充养脑髓、安神宁志。研究[12]表明,针刺“百会”等督脉穴不仅可以改善学习记忆能力,而且能促进脑缺血大鼠脑白质髓鞘再生。本实验通过Morris水迷宫观察发现,艾灸干预后VD大鼠的逃避潜伏期比治疗前显著减少,说明化瘀通络灸能改善VD大鼠学习记忆能力。这与课题组前期报道[13]的化瘀通络灸能够明显改善VD大鼠学习记忆能力的研究结果一致。

脑白质由许多髓鞘化的轴突组成,其基础代谢率高,因此即使是轻微缺血也会造成脑白质损伤。胼胝体是大脑最大的白质带,是VD的主要损伤部位,故选用胼胝体作为VD白质损伤的观察对象。髓鞘是白质中必不可少的成分,由成熟少突胶质细胞发出的细胞突起包裹神经细胞轴突形成。髓鞘的完整性对脑白质功能的恢复至关重要,因此髓鞘脱失也会引起以认知障碍为主的一系列临床综合征[14]。当提供营养支持时,脑白质中的髓鞘被激活,发生增殖,并迁移到损伤部位,使髓鞘重新包裹轴突,这个过程称为“髓鞘再生”[15]。同时实验研究[16]证明,氯马斯汀(H1受体拮抗剂)具有增强少突胶质细胞分化和促进髓鞘再生的作用,因此本研究选择氯马斯汀作为阳性对照药。

MAG是构成髓鞘的重要成分之一,其表达在髓鞘的最内层,直接与轴突表面相邻,具有稳定轴-髓鞘方面的作用、维持髓鞘结构的完整性等[17]。有研究[18]报道,脱髓鞘会导致MAG损失,MAG可能是髓鞘形成所必需的物质。MBP位于髓鞘浆液表面,是髓鞘的特异性标志物,可启动髓鞘的合成,稳定髓鞘的结构[19]。同时既往实验[20]表明,大脑缺血损伤后,髓鞘相关蛋白MAG、MBP含量明显降低。因此,髓鞘相关蛋白MAG、MBP表达水平的高低可反映髓鞘再生情况和中枢神经系统功能恢复程度。

本研究结果表明,与假手术组比较,模型组大鼠髓鞘相关蛋白MAG、MBP表达水平均显著降低(P<0.05);与模型组比较,艾灸组髓鞘相关蛋白MAG、MBP表达水平均显著升高(P<0.05)。结果提示化瘀通络灸能够促进髓鞘相关蛋白MAG、MBP的合成,促进髓鞘再生。与西药组比较,艾灸组MAG表达水平升高(P<0.05),说明艾灸组的疗效优于西药组;艾灸组MBP表达趋势略优于西药组,但差异无统计学意义(P>0.05),究其原因可能与样本量不足有关。由此推断,艾灸能够加快大鼠脑白质髓鞘损伤的修复,从而证实化瘀通络灸可以促进髓鞘再生,对促进髓鞘再生起到积极作用。

综上,化瘀通络灸能促进VD大鼠髓鞘相关蛋白MAG、MBP的合成,促使髓鞘再生,从而改善VD大鼠的学习记忆能力。

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