裴巧林，陈德芳，张小丽，李良玉

(1.四川农业大学动物科技学院，四川 成都 611130；2.成都市农林科学院水产研究所，四川 成都 611130)

2021年，我国小龙虾养殖总产量达263.36万吨，位居淡水养殖品种第6位。然而，春夏交替季节小龙虾病害时有发生，“五月瘟”、豚鼠气单胞菌(Aeromonas caviae)(曹海鹏等，2014)、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)(马小荣等，2012)和维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)(胡骞等，2020)感染引起小龙虾烂鳃、溃疡和肠炎等疾病是养殖中的常见病害。2022年6月初，四川崇州养殖的小龙虾表现为体形消瘦、体色加深、活力较差、螯足无力、断须且断面发黑、尾柄有水泡等症状，死亡率在30%左右。

本研究针对该病例开展了病原鉴定和体外药物筛选工作，以期为小龙虾的健康养殖和细菌性疾病防控提供参考。

一、材料与方法

1.细菌分离与鉴定 取典型患病的小龙虾，体重(14.08±1.0)克，用75%酒精对其体表进行消毒，无菌操作取其肝胰腺组织，划线接种于TSA培养基上，将培养基放置于30℃的恒温培养箱中，24小时之后取出培养基进行观察，发现培养基表面的菌落光滑、有光泽、半透明状；挑选菌落进行纯化，革兰氏染色发现其为革兰氏阴性菌，短杆状；对菌种使用试剂盒提取细菌基因组DNA，采用细菌通用引物进行16S rRNA基因的PCR扩增，PCR产物送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，序列与NCBI数据库进行BLAST比对。

2.组织病理观察采集患病小龙虾的鳃、肝胰腺、肠道组织，经固定、脱水、透明、浸蜡、包埋、切片等步骤处理，切片厚度为4微米，组织切片用苏木精—伊红(HE)染色，用中性树脂封片，再用显微镜观察拍照。

3.药敏试验 用棉签蘸取少量菌液均匀涂抹在TSA培养基上，采用标准Kirby-Bauer纸片扩散法对庆大霉素、氟苯尼考、恩诺沙星和多西环素等11种药物的敏感性进行检测，以抑菌圈直径作为判定标准，确定致病菌株对药物的敏感程度。

二、结果

1.剖检观察 对12尾病虾进行剖检观察，剪取少量鳃丝制作水压片，在显微镜下观察，未发现寄生虫。剖检可见病虾鳃丝发黑、头胸甲内有少量积液、肝胰腺发黑，部分病虾肝胰腺颜色呈浅黄色、空胃、空肠、有肠炎。

2.致病菌的鉴定 提取细菌基因组DNA后，采用PCR扩增16S rRNA序列并测序，扩增获得的序列在NCBI上进行BLAST比对。结果显示，分离菌的16S rRNA序列与数据库中的弗氏柠檬酸杆菌同源性最高，达99.8%以上。进一步通过构建系统发育树发现，分离菌Pc202006株与弗氏柠檬酸杆菌聚为一支(图1)，确诊该菌为弗氏柠檬酸杆菌。

图1 分离菌的系统发育树

3.组织病理观察 患病小龙虾肝胰腺组织结构松散，呈坏死状态；肝小管腔扩大或形态不完整，管腔破裂；肝小管上皮储存细胞(R细胞)、分泌细胞(B细胞)等大量坏死解体或空泡化，部分破裂组织落入管腔(图2A)。一些细胞内有巨大空泡形成，呈海绵状；分泌细胞的完整性缺失，细胞内出现内含棕色颗粒的转运小泡(图2B)。鳃丝结构模糊，但鳃膜结构清晰，鳃膜和呼吸上皮细胞分离形成较大空腔，呼吸上皮细胞坏死，细胞轮廓消失，细胞核肿大裂解，排列不整齐，嗜酸性粒细胞增多(图2C)。皱嵴结构受损；柱状上皮组织坏死，核裂解；结缔组织部分坏死溶解，部分区域和肌肉层脱离形成空腔，出现炎性细胞浸润(图2D)。

图2 患病小龙虾肝胰腺、鳃和肠道病理变化

4.致病菌的药敏性Kirby-Bauer纸片扩散法药敏试验结果表明，在11种抗菌药中，分离菌株对庆大霉素、氟苯尼考和恩诺沙星敏感，对于多黏菌素B和多西环素介于敏感和耐药之间，对复方新诺明、青霉素、新霉素等耐药(表1)。

表1 弗氏柠檬酸杆菌药敏试验结果

三、分析与讨论

弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)为隶属于肠杆菌科、柠檬酸杆菌属的革兰氏阴性短杆菌。该菌具有鞭毛，菌毛遍布菌体，无荚膜，广泛分布于自然界，是人和动物肠道的正常菌群。杨方园(2013)等报道弗氏柠檬酸杆菌导致花鳗鲡(Anguilla marmorata)鳃部严重肿胀、鳃丝溃烂、肝脏充血、胆囊肿大，累计死亡率可达30%。张东星等(2016)报道团头鲂(Megalobrama amblycephala)经人工感染弗氏柠檬酸杆菌之后，可导致团头鲂腹部、鳔、肝脏严重出血，肾脏和脾脏肿大而死亡。石征宇等(2018)从罗非鱼(Oreochromis mossambicus)心脏中分离出弗氏柠檬酸杆菌，回归感染7天死亡率达93.3%。小龙虾中弗氏柠檬酸杆菌感染的报道逐年增加。陈红莲等(2014)从活力较差、体表无溃疡、肝胰腺颜色变浅、空肠、空胃的患病小龙虾肝胰腺中分离到弗氏柠檬酸杆菌。唐庆权等(2019)从患病小龙虾肝胰腺中分离出弗氏柠檬酸杆菌，病虾的主要症状为摄食量减少、螯足无力、活力较差、抗应激能力较差，部分个体体表变黑，解剖发现肝胰腺颜色变浅。

本研究中，弗氏柠檬酸杆菌感染的主要症状为病虾鳃丝发黑、头胸甲内有少量积液、肝胰腺发黑，部分病虾肝胰腺颜色为浅黄色、空胃、空肠且肠道变蓝等。此次小龙虾发病前崇州的气温突然升高，白天平均气温达到32℃左右。温度的升高导致池塘中藻类大量繁殖、溶氧降低，小龙虾的应激变大、抵抗力下降，同时促进了小龙虾的摄食，排泄物和残饵也增加，加剧水质变差，使得病原菌更加容易滋生。

本研究分离株对庆大霉素、氟苯尼考和恩诺沙星敏感，但分离株对同为氨基糖苷类的药物新霉素耐药。岳刚毅等(2011)研究揭示口服氟苯尼考可通过小龙虾的胃肠道迅速吸收，血药浓度达峰时间为1.00小时，血淋巴中药物消除半衰期为10.01小时，而生物利用度较低，仅为21.6%。甲壳动物的肝胰腺不仅是药物吸收器官，也是药物代谢消除器官，氟苯尼考经肝胰腺代谢消除后再进入血淋巴的药量减少，引起生物利用度变低。因此在使用氟苯尼考时需要考虑其在体内的代谢速度和血药浓度。恩诺沙星是本研究分离株另一敏感药物，在已报道的四川内江、广东三水、江苏扬州、安徽滁州等地虾柠檬酸杆菌的药敏结果中，恩诺沙星普遍表现出了良好的杀菌作用。钱云云等(2007)研究发现恩诺沙星在罗氏沼虾中的组织渗透能力较强，其在组织中的药物浓度高于血淋巴。

从组织病理来看，病虾肝胰腺、鳃和肠道组织出现明显的病理特征。在肝胰腺中，肝胰腺小管是其结构和功能的基本单位。肝小管内常见4种细胞，即分泌细胞、储存细胞、纤维细胞和胚细胞，其中分泌细胞和储存细胞数量较多(陶易凡等，2016)。本研究发现，病虾肝胰腺组织结构损伤，肝小管腔扩大或形态不完整，B细胞、R细胞严重空泡化，与Liu等(2020)研究结果一致。但Liu等(2020)观察到肝胰腺上皮细胞与结缔组织分离，与本次研究结果不同。此外，本研究还发现病虾肝胰腺B细胞内出现含有棕色颗粒的转运小泡，胡骞等(2020)在维氏气单胞菌感染的小龙虾肝胰腺组织病理学研究中也观察到了这种现象，而棕色颗粒的实质以及其产生的机制还有待进一步研究。本次研究观察到微血腔结缔组织消失，无血细胞，说明鳃的基本功能已经受损。鳃丝结构模糊、鳃膜和呼吸上皮细胞分离、呼吸上皮细胞坏死、嗜酸性粒细胞增多，这些表现与Liu(2020)等结果一致。此外，BALDISSERA M D等(2018)还发现，弗氏柠檬酸杆菌通过抑制肌酸激酶，从而影响鳃的代谢，造成鳃损伤，这为病原菌造成小龙虾鳃损伤机制的研究提供了思路。观察病虾肠道，发现肠道皱嵴结构受损、柱状上皮组织坏死、结缔组织部分坏死溶解、部分区域和肌肉层脱离形成空腔、出现炎性细胞浸润，与草鱼被病原菌感染后的肠道组织相似；不同的是草鱼肠道未出现明显的炎症反应和结缔组织与肌肉层脱离的现象，这可能是因为鱼类免疫系统的发达程度高于甲壳类动物(XIONG F等，2020)。