曾自珍 王利胜

1.广州医科大学附属第六医院清远市人民医院药学部，广东清远 511500；2.广州中医药大学中药学院，广东广州 510006

据《神农本草经》中记载，川芎是十分常见的一种伞形科植物，根茎部分的药用价值最高，且具有活血行气，祛风止痛的作用，川芎嗪别名四甲基吡嗪[1]，它主要提取自川芎根茎部分，且是其中最核心的活性生物碱，在临床中有扩张小动脉、改善微循环等药理价值[2-3]，在心脑血管、呼吸科、泌尿科等多个科室治疗中都能看到其身影，尤其适用于缺血性脑血管疾病的治疗[4-6]，已逐渐成为现在临床中药制剂中最有效的药物之一。冰片能通过人体局部对药物的吸收，引药上行，并穿透血脑屏障[7]，并能促进四甲基吡嗪在胃肠道的吸收[8]，多参与治疗心脑血管疾病的过程中[9-10]，有一定疗效。

为了使川芎嗪在脑血管疾病治疗中的效果更佳，很多研究将其与其他药物相互配合使用，进而能够发挥更佳的开窍醒脑、穿透血脑屏障等作用[11]。芎冰滴丸是由川芎提取物、冰片和基质按一定比例制成的滴丸制剂。将川芎和冰片配伍制成滴丸剂型能提高生物利用度，增加稳定性和降低刺激性等优点。其有效性决定其的应用面广，且心脑血管产品的市场巨大，因此也会吸引企业生产此药，制定其标准是十分必要的。因此，选择芎冰滴丸的质量标准的研究作为课题，使其建立明确的质量标准，提出量控指标，为企业的生产提供检验依据，从而达到有效控制其质量的目的，实现此药品的有效性与稳定性的统一。

在此次研究过程中，利用薄层色谱对本品质量进一步管理和识别，将阿魏酸（ferulic acid，FA）设定为质量控制指标，利用高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）法来测量和明确其在芎冰滴丸中的具体含量，然后进一步深化与升级对其的测量方法，以明确芎冰滴丸的质量标准。

1 仪器与试剂

1.1 仪器

高效液相色谱仪（美国DIONEX 公司，包括P680泵、TCC-100 柱温箱、UVD17OU 紫外检测器和Chromeleon 液相色谱工作站），Platisil ODS 柱（5 μm，250 mm×4.6 mm）；RE-2000 旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；SHD-Ⅲ真空泵（巩义市予华仪器有限责任公司）；恒温水浴锅（上海新苗医疗器械制造有限公司）；TGL-16B 台式离心机（上海安亭科学仪器厂）；AUW120D 十万分之一分析天平（日本岛津）。

1.2 药物与试剂

FA 对照品（中国药品生物制品鉴定所，批号：110773-200711，供含量测定用）；川芎对照品（中国药品生物制品鉴定所，批号：120918-200703）；甲醇为分色谱级（天津赛孚瑞科技有限公司,批号：20090101 001）；硅胶G（青岛海洋化工厂）、硅胶GF254（青岛海洋化工厂）；石油醚、乙醚、环己烷、乙酸乙酯分析纯；芎冰滴丸（由广州中医药大学自制，规格：每丸重40 mg）

2 方法与结果

2.1 溶液的制备

2.1.1 川芎对照品溶液 称取1 g 川芎对照药材，将其与50 ml 的石油醚相混合，利用超声技术处理15 min，过滤，然后利用2 ml 的乙酸乙酯将残渣进行溶解，得到川芎对照药材溶液。

2.1.2 滴丸样品溶液1 和阴性溶液 随机选择20 丸样品，按照“2.1”项下方法制备得到滴丸样品溶液1；结合处方工艺制备出不含川芎的阴性制剂，按照“2.1”项下方法制备得到阴性对照溶液。

2.1.3 冰片对照品溶液 称取一定数量的冰片，乙醇溶解，得到每1 ml 中含0.5 mg 的溶液，得到冰片对照药材溶液。

2.1.4 滴丸样品溶液2 溶液 选取样品50 丸，10 ml 乙醇溶解过夜，滤纸过滤，滤液作为滴丸样品溶液2 溶液。

2.1.5 供试品溶液的制备 取1 g 样品，将其与蒸馏水共同置于锥形瓶里，利用超声技术对其处理5 min，过滤，放在分液漏斗中，加入乙醚振摇提取3 次，每次0.5 h，合并3 次的乙醚液后用无水硫酸钠脱水，挥干乙醚液，利用甲醇对残渣进行溶解，并将其重新放置在25 ml 的量瓶内，摇匀，利用0.22 μm 微孔滤膜滤过，即得。

2.1.6 对照品溶液的制备 精密称量出10.60 mg 的FA，将其与甲醇混合共同放于50 ml 的量瓶内，再次与甲醇结合，摇匀，得到浓度为0.212 mg/ml 的对照品溶液。

2.2 薄层色谱鉴别

2.2.1 川芎的薄层鉴别 取川芎对照药材溶液、滴丸样品溶液1、川芎阴性溶液和空白基质，采用薄层色谱法[12]进行识别，分别取以上溶液各2～5 μl，将其点于同一硅胶G 薄层板上，以环己烷-乙酸乙酯（9∶1）为展开剂展开，然后将其放置于紫外光灯（波长为365 nm）下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；阴性对照未见干扰（图1）。

图1 芎冰滴丸川芎薄层色谱图

2.2.2 冰片薄层色谱鉴别 取冰片对照药材溶液、滴丸样品溶液2 和川芎对照药材溶液，采用薄层色谱法[12]试验，将以上溶液分别吸取10 μl，分别点于同一硅胶G 薄层板上，展开剂为石油醚（30～60℃）-醋酸乙酯（17:3），展距8 cm。将其取出自然风干，喷上5%香草醛硫酸溶液，用热风持续吹干，直到显色清楚。在得出的供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点（图2）。

图2 芎冰滴丸冰片薄层色谱图

2.3 含量测定的条件及优选

2.3.1 色谱条件 色谱柱：Platisil ODS 柱（5 μm，250 mm×4.6 mm）；流动相：甲醇-0.1%磷酸水溶液（50∶50）；检测波长为323 nm；进样量10 μl；柱温35℃。

2.3.2 标准曲线的制备 分别精密吸取“2.1.6”项下的对照品溶液0.l、0.4、1.2、2.0、3.0、4.0、5.0 ml 注入液相色谱仪测定峰面积，以FA 浓度为横坐标，峰面积积分值为纵坐标，得标准曲线。经计算，得回归方程为：A=0.8249C+0.5818，R2=0.9992。结果表明FA 在2.12～106.00 μg/ml 范围内呈良好线性关系（图3）。当FA浓度分别为 2.12、8.48、25.44、42.40、63.60、84.80、106.00 μg/ml 时，峰面积平均积分值分别对应1.989、6.980、21.877、35.499、54.374、71.277、86.626 mAUmin。

图3 FA 标准曲线

2.3.3 专属性实验 结合处方工艺制备不包括川芎的阴性制剂，结合供试品溶液的操作流程来进行阴性样品的制备，相同色谱条件下进样，记录色谱图，在与FA 相应的峰位处没有吸收峰出现，结果为其他药材对FA 的含量测定没有影响，专属性良好（图4）。

图4 芎冰滴丸的HPLC 图谱

2.3.4 精密度试验 精准吸取对照品溶液10 μl，将其放置于液相色谱仪内，对其定峰面积进行测量，连重复操作5 次，最终得出RSD=1.78%，表明仪器精密度良好。

2.3.5 重复性试验 精准称量5 份样品，每份重量为1 g，按照“2.1.1”项下方法制备得到供试品溶液，分别吸取10 μl，注入液相色谱仪进行测定，同样对其面积进行测量，最终得出FA 的均量为0.975 mg/g，RSD=2.31%，重复性良好。

2.3.6 回收率试验 取样品5 份，按照“2.1.1”项下方法制备得到供试品溶液，利用加样回收法，分别加入2 ml 的对照品溶液，精密吸取10 μl，将其注入高效液相色谱仪，计算回收率，结果RSD=2.27%。

2.3.7 指标成分的选择 作为方中君药之一，其最关键的成分就是酚性成分FA、挥发油类藁本内酯等。作为主要有效成分的FA 能明显扩张冠脉，增加冠脉血流量，改善心肌供氧状况；抑制大脑皮层活动，抑制醋酸所致小鼠扭体反应等作用[13]。所以把FA 作为质量控制的指标，采用HPLC 法对其含量进行测定。

2.3.8 供试品中FA 的含量测定 按照“2.1.5”项下方法制备3 批样品的供试品溶液，精密吸取10 μl，注入液相色谱仪测定峰面积，计算3 批样品中FA 的含量。由实验结果暂定本品每丸含川芎以FA（C10H10O4）计，不得少于0.03 mg。

2.3.9 川芎药材中FA 含量测定 根据赵奎君[6]的研究，因产地的不同，川芎质量差异较大，为了有效控制原料质量，同时避免盲目投料，经对药材的含量测定和比较，优质药材中FA 含量均大于0.4 mg/g，所以暂定投料川芎药材中FA 的含量限度为不低于0.4 mg/g。

3 讨论

在最近几年中，随着药理学的进步以及医学研究的深入，使得中药滴丸剂在原有的基质与冷凝剂前提下进行了多次优化与升级。聚乙二醇类聚合物（PEG类）自身是没有任何生理作用的[14]，而且极易溶于水中，进而可以促进药物更好融化，另外还能帮助患者进一步吸收。但是通过试验后发现，尽管PEG4000 有极强的成型性，但是硬度有限，而PEG6000 则正好与之相反，所以在制备滴丸时将二者按一定比例混合共同作为滴丸剂的基质。通过多次试验后发现，将上述两者根据1∶3 比例进行结合，来作为滴丸剂的基质，其整体效果会更佳。

再进一步探讨滴丸工艺的同时，计划利用拖尾、黏连等相关指标对其展开评估。结果通过试验发现不同滴制条件下滴丸的溶散时限相差不大，均在3～10 min，无显著性差异，故只采用滴丸硬度、圆整度、拖尾、粘连为指标对其进行评价[15]。采用最有效的制备方式来对滴丸样品评价，最终结果表明这些样品的溶散时限都能达标，且溶散时限几乎都在3～8 min，这就代表滴丸的质量是可靠的；而滴丸外观硬度、圆整度等同样也可以为其质量评估发挥重要作用。

方中FA 进行含量测定时，刚开始时未采用乙醚除杂，直接用乙醚提取有效成分，结果注入液相色谱仪后发现样品中杂质较多，FA 色谱峰有干扰，且基线漂移积分不准，故在提取有效成分用乙醚进行除杂处理，结果经过除杂后，FA 色谱峰没有干扰，阳性结果较好，基线平稳，故采用乙醚萃取处理法处理。

当前，很多学者就川芎中涉及FA 成分等内容进行过多次研究，且均使用的是HPLC、毛细管电泳法等[16-18]。笔者在本研究过程中，利用HPLC 对其含量进行了精准测定，并参考有关学术资料[19]流动相采用酸性溶剂时FA 的分离度好，参照文献[20]经实验后表明，采用甲醇-0.1%磷酸溶液（50∶50）为流动相，对样品中FA 分离度均较好，出峰时间大约为10 min。综上所述，本实验建立的薄层和含量测定方法，操作简便，重现性好。可作为芎冰滴丸的质量控制标准。