梁结斐 陈震尧 吴伟斌

1.肇庆医学高等专科学校药学院，广东肇庆 526020；2.广东省肇庆市中医院药剂科，广东肇庆 526020；3.肇庆医学高等专科学校基础医学院，广东肇庆 526020

《中国2 型糖尿病防治指南（2020 年版）》数据显示，我国18 岁及以上人群糖尿病患病率为11.2%[1]。国内研究表明，胰岛β 细胞功能减退是我国居民2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）遗传易感性的主要因素[2]，而高血糖[3]及高血脂[4]是诱发胰岛β 细胞功能减退的常见原因。上述两种因素损伤胰岛β 细胞的机制与诱发氧化应激[5]、内质网应激[6]、线粒体功能障碍[7]及自噬[8]有关，加上与胰岛β 细胞自身的低抗氧化应激能力[9]的共同作用下，机体逐渐发展为糖尿病。四氧嘧啶（alloxan，ALX）是一种常见的用于制备糖尿病在体动物或离体细胞模型的细胞毒性试剂，可通过升高细胞内活性氧及诱发胰腺炎症等方式诱导胰岛β 细胞凋亡或坏死[10-11]。番石榴叶（Psidium guajava leaves，PGL）是桃金娘科植物番石榴的叶，是两广及福建地区的一种常见茶饮原料，其提取物具有镇痛[12]、抗氧化[13]、抗肿瘤[14]及护肝[15]等多种药理作用。在抗糖尿病方面，PGL 提取物已被证明可通过抑制NF-κB 通路及激活AMPK 通路等机制对糖尿病大鼠的心肌[16]、骨骼肌及肝细胞[17]实现保护作用。但PGL提取物能否对胰腺β 细胞具有保护作用及其可能机制尚未清楚。本研究利用ALX 诱导INS-1 细胞构建氧化应激模型，旨在探讨PGL 水提物对INS-1 细胞的保护作用及其可能的机制，为进一步开发利用PGL水提物提供前期基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

研究对象为大鼠胰岛细胞瘤细胞株INS-1，购自中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心。

PGL 水提物干粉（江西沐恩堂生物科技有限公司，批号：200517）；RPMI 1640（美国Hyclone 公司，货号：8121303）；胎牛血清（浙江天杭生物科技股份有限公司，货号：13011-8611）；2-巯基乙醇、ALX、TBST即用干粉（上海麦克林生化科技有限公司，货号：M6230、A800714、T854550）；CCK-8（上海MedChemExpress 公司，货号：HY-K0301）；发光法细胞活力检测试剂盒、抗荧光淬灭封片液（含Hoechst 33342）、Annexin V-FITC 细胞凋亡检测试剂盒、活性氧检测试剂盒、Rhodamine 123（RHD 123）、BCA 蛋白浓度测定试剂盒、细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒、裂解液、封闭液、ECL 化学发光试剂盒（上海碧云天生物科技有限公司，货号：C0069、P0133、C1062、S0033、C2007、P0010、P0028、P0013、P0252、P0018A）；Bcl-2、Bax、Cleaved-Caspase 3、GRP78、CHOP、Nrf2、HO-1、Tubulin、Lamin B1 及Goat Anti-Rabbit IgG（H+L）HRP 抗体（江苏亲科生物研究中心有限公司，货号：AF6139、AF0120、AF7022、AF5366、AF5280、AF0639、AF7018、AF7011、AF5161、S0001）；PVDF膜（美国Millipore 公司，货号：IPVH00010）。

MCO-18AC 二氧化碳培养箱（日本Panasonic 公司）；SPARK 多功能酶标仪（瑞士Tecan 公司）；BX53正置荧光显微镜及Ⅸ73 荧光倒置显微镜（日本Olympus公司）；CytoFLEX 流式细胞仪（美国Beckman Coulter公司）；SimpliNano 核酸蛋白检测仪（美国GE 公司）；Powerpac Universal 电泳仪电源（美国Bio-Rad 公司）；iBright FL1000 显影仪（美国Invitrogen 公司）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及分组 大鼠胰岛细胞瘤细胞株INS-1按照RPMI 1640+10%FBS+50 μmol/L 2-巯基乙醇的配方配置完全培养基进行培养；后续实验分组如表1。

表1 实验分组及诱导条件

1.2.2 细胞活力检测 取对数生长期细胞，胰酶消化后，用无血清培养基重悬，计数后按每孔1×103个细胞铺入96 孔板，无血清培养过夜，然后按表1 分组换入相应培养基，诱导相应时间后，换入含CCK8 的完全培养基后，把微孔板放入培养箱中避光孵育60 min，最终利用多功能酶标仪检测450 nm/620 nm（检测波长/ 参照波长）波长处的吸光度，以0 mmol 组或Control 组为100%换算各组相对存活率，每次实验每组设置6 个复孔，重复3 次。

1.2.3 化学自发光法检测细胞内ATP 的含量 取对数生长期细胞，胰酶消化后，用无血清培养基重悬，计数后按每孔1×103个细胞铺入全白96 孔板，无血清培养过夜，然后按Control，ALX20，PGL 25、50、100 μg/ml的分组换入相应培养基并诱导4 h 后，按发光法细胞活力检测试剂盒要求换入检测液后，用酶标仪检测孔板中化学发光强度，每次实验每组设置6 个复孔，重复3 次。

1.2.4 荧光显微镜观察凋亡形态学、细胞内ROS 及线粒体膜电位 取对数生长期细胞，胰酶消化后，用无血清培养基重悬，计数后按每孔1×105个细胞铺入预先放置盖玻片的6 孔板制备细胞爬片，无血清培养过夜，按Control，ALX20，PGL 25、50、100 μg/ml 的分组换入相应培养基并诱导24 h 后，取细胞爬片按照Hoechst 33342 染色液的说明书进行封片染色，利用正置荧光显微镜进行观察，每次实验每组设置3 个复孔，重复3 次。

取对数生长期细胞，胰酶消化后，用无血清培养基重悬，计数后按每孔1×105个细胞铺入6 孔板，无血清培养过夜，然后按Control，ALX20，PGL 25、50、100 μg/ml 的分组换入相应培养基并诱导4 h 后，吸弃上清后，加入配置好的ROS 或Rhodamin 123 检测试剂，避光37℃孵育15 min，PBS 荡洗3 次，利用倒置荧光显微镜进行观察，每次实验每组设置3 个复孔，重复3 次。

1.2.5 流式细胞术检测细胞凋亡、细胞内ROS 及线粒体膜电位 取对数生长期细胞，胰酶消化后，用无血清培养基重悬，计数后按每孔1×105个细胞铺入6 孔板，无血清培养过夜，然后按Control，ALX20，PGL 25、50、100 μg/ml 的分组换入相应培养基并诱导4 h 或24 h 后，消化并以1 000 r/min、半径8.2 cm、离心5 min收集细胞，吸弃上清后，按AnnexinV-FITC、活性氧及RHD 123 试剂盒要求进行孵育，最后利用流式细胞仪进行检测，每次实验每组设置3 个复孔，重复3 次。

1.2.6 Western blot 取对数生长期细胞，胰酶消化后，用无血清培养基重悬，计数后按每孔1×105个细胞铺入6 孔板，无血清培养过夜，然后按Control，ALX20，PGL 25、50、100 μg/ml 的分组换入相应培养基，诱导4 h 或24 h 后，消化离心收集细胞，向离心管中加入200 μl 裂解液提取总蛋白，然后利用核酸蛋白定量仪进行蛋白定量，均一化蛋白浓度后，加入上样缓冲液制备蛋白样品。电泳分离、转膜、脱脂奶粉封闭后，配置好所需检测蛋白的一抗（1∶1 000），低温摇床4℃过夜孵育，次日以PBST 荡洗后，室温孵育二抗（1∶5 000）1 h，最终利用显影仪检测以获得蛋白表达量数据，实验重复3次。

1.3 统计学方法

采用SPSS 25.0 统计学软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（）表示，多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用LSD-t 检验；图像资料利用Image J 进行半定量分析，GraphPad 8 软件制作数据图，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PGL 水提物对ALX 诱导INS-1 损伤细胞活力的影响

为确立合适的损伤浓度，梯度浓度的ALX 干预INS-1 细胞24 h 后发现，5 mmol 的ALX 组细胞活力低于0 mmol 组，差异有统计学意义（P＜0.05）（图1A），且高浓度ALX 组的细胞活力低于低浓度ALX 组，因此根据研究需求选择损伤程度适中的浓度进行后续的研究，最终以20 mmol ALX 为建立损伤模型的诱导浓度。确定了损伤浓度后，为建立非损伤性的氧化应激模型，确立相应的诱导时间，以20 mmol ALX 诱导不同时间后发现，当ALX 诱导时间达到6 h 时，INS-1 细胞活力低于Control 组，差异有统计学意义（P＜0.05）（图1B），故确定非损伤性的氧化应激模型诱导时间为4 h。为确立研究所使用的药物剂量，梯度浓度的PGL 水提物干预INS-1 细胞24 h 后发现，当PGL 水提物浓度达到200 μg/ml 时，INS-1 细胞活力低于0 μg/ml 组，差异有统计学意义（P＜0.05）（图1C），故后续研究使用不高于200 μg/ml 的剂量进行。建立稳定的ALX 损伤模型并确立安全给药剂量后，在此基础上对PGL 水提物保护作用开展研究，结果显示，25 μg/ml 的PGL 水提物组INS-1 细胞活力高于ALX组，差异有统计学意义（P＜0.05）；100 μg/ml 的PGL水提物组INS-1 细胞活力低于Control 组，差异有统计学意义（P＜0.05）（图1D）。

图1 药物对INS-1 细胞活力的影响

2.2 PGL 水提物对ALX 诱导INS-1 细胞凋亡及相关蛋白表达的影响

20 mmol ALX 干预24 h 可诱导INS-1 细胞凋亡，利用Hoechst 33342 染色后在荧光显微镜下观察，ALX20 组呈现典型核固缩细胞显著增多（图2A），而PGL 水提物能剂量依赖地减少核固缩的发生。利用Annxin V-FITC 法结合流式细胞仪检测也发现，PGL水提物能剂量依赖地减少凋亡细胞的占比（图2B），逆转ALX 所诱发的凋亡，保护INS-1 细胞。ALX20 组Bax 及Cleaved-Caspase 3 蛋白的表达量高于Control组，Bcl-2 的表达则低于Control 组，差异有统计学意义（P＜0.05）。PGL 水提物Bax 及Cleaved-Caspase 3蛋白的表达量低于ALX20 组，高于Control 组，Bcl-2的表达高于ALX20 组，低于Control 组，差异有统计学意义（P＜0.05）（图3）。

图2 PGL 水提物对ALX 诱导INS-1 细胞凋亡的影响（400×）

图3 PGL 水提物对ALX 诱导INS-1 细胞Bcl-2、Bax 及Cleaved-Caspase 3 表达的影响

2.3 PGL 水提物对ALX 诱导INS-1 细胞内ATP 含量及线粒体膜电位的影响

经过20 mmol ALX 诱导4 h 建立氧化应激模型，其细胞内ATP 含量及线粒体膜电位低于Control 组，差异有统计学意义（P＜0.05）；PGL 水提物各剂量组细胞内ATP 含量及线粒体膜电位均高于ALX20 组，低于Control 组，差异有统计学意义（P＜0.05）（图4～5）。

图4 PGL 水提物对ALX 诱导INS-1 细胞内ATP 含量的影响

图5 PGL 水提物对ALX 诱导INS-1 细胞线粒体膜电位的影响（400×）

2.4 PGL 水提物对ALX 诱导INS-1 细胞内氧化应激及抗氧化应激蛋白表达的影响

利用ALX 诱导INS-1 细胞4 h 建立氧化应激模型，可见ALX20 组细胞内活性氧含量高于Control组，差异有统计学意义（P＜0.05）；PGL 水提物各剂量组细胞内活性氧含量皆低于ALX20 组，高于Control组，差异有统计学意义（P＜0.05）（图6）。Nrf2 通路是细胞内关键的抗氧化应激通路，上调该通路功能可有效保护胰腺细胞免受氧化应激损伤，结果显示，PGL水提物各剂量组Nrf2 及HO-1 蛋白的表达量皆高于ALX20 组和Control 组，差异有统计学意义（P＜0.05），且PGL 水提物各剂量组的Nrf2 核转位的程度高于ALX20 组，差异有统计学意义（P＜0.05）（图7）。

图6 PGL 水提物对ALX 诱导INS-1 细胞内活性氧含量的影响

图7 PGL 水提物对ALX 诱导INS-1 细胞Nrf2 和HO-1 表达及Nrf2 核转位的影响

2.5 PGL 水提物对ALX 诱导INS-1 细胞内质网应激相关蛋白表达的影响

ROS 升高、内质网应激及细胞凋亡是三种常见的并行机制介导糖尿病机体多种脏器的病变，利用ALX诱导INS-1 细胞4 h 后发现，ALX20 组的GRP78 及CHOP 两个内质网应激特征蛋白的表达高于Control组，差异有统计学意义（P＜0.05）；PGL 水提物各剂量组的GRP78 及CHOP 表达量均低于ALX20 组，高于Control 组，差异有统计学意义（P＜0.05）（图8）。

图8 PGL 水提物对ALX 诱导INS-1 细胞GRP78 和CHOP 表达的影响

3 讨论

流行病学调查显示，2020 年，我国大陆地区成年人糖尿病患病率为12.8%，糖尿病前期患病率高达35.2%[18]，对当下及未来一段时间内中国人民的身体健康及国家医疗卫生支出都将产生巨大的负担。研究表明[19]，我国居民的饮食习惯改变使得近年高血糖高血脂等问题日渐加剧，而过高的血糖及血脂对胰腺等脏器产生显著糖脂毒性，诱发全身多种细胞胰岛素抵抗，进而增加胰腺细胞的工作负担，导致胰腺功能减退并最终引发糖尿病[20]。研究表明，糖脂毒性主要通过氧化应激[21]、内质网应激[22]、线粒体功能紊乱[23]及炎症[24]等机制介导了胰腺细胞的功能失调及凋亡，而天然产物在对抗上述致病机制方面具有很好的疗效[25]。ALX 是一种能特异性损伤胰岛β 细胞、建立糖尿病动物模型的造模剂[26]，常用于构建体内外胰岛β 细胞损伤模型。

本研究通过ALX 诱导大鼠胰岛细胞瘤细胞株INS-1 建立胰岛β 细胞体外氧化应激模型，研究PGL 水提物对胰岛β 细胞的保护作用及其可能的机制。已有研究表明，过度升高的活性氧结合细胞内相对较弱的抗氧化应激能力，可引发线粒体功能紊乱[27]，使得葡萄糖利用能力下降，ATP 合成减少，进而线粒体质量下降，膜电位丢失，最终引发凋亡。本研究结果显示，非毒性浓度的25～100 μg/ml PGL 水提物能有效对抗20 mmol ALX 所诱导的INS-1 细胞活力下降，呈剂量依赖性地恢复细胞活力，提高细胞内ATP含量，回升线粒体膜电位，减少核固缩细胞占比，降低细胞凋亡率，其机制可能与PGL 水提物可改善线粒体功能、提高Bcl-2 表达、降低Bax 表达并减少Cleaved-Caspase 3 的表达有关，该机制最终阻断了Caspase 3 途径所介导的细胞凋亡，实现逆转ALX 诱导INS-1 细胞损伤的作用。

ALX 诱导β 细胞凋亡，除与线粒体功能紊乱有关外，还与上调细胞内氧化应激及内质网应激[28]有关，且前期研究表明PGL 提取物具有显著体外抗氧化的作用。本研究结果显示，PGL 水提物能有效降低细胞内活性氧含量，其调控机制与PGL 水提物能上调Nrf2 及HO-1 蛋白表达并促进Nrf2 核转位、增强细胞抗氧化应激通路功能有关。除此以外，PGL 水提物还能下调GRP78 及CHOP 的表达，缓解内质网应激，通过多靶点的作用实现对ALX 诱导体外INS-1细胞凋亡的保护作用，但PGL 水提物能否在ALX 诱导的在体糖尿病模型上表现出胰腺保护作用，仍有待进一步的研究。

综上所述，PGL 水提物可通过调控线粒体功能、减轻细胞内氧化应激及内质网应激对ALX 诱导体外胰岛细胞凋亡模型实现保护作用。