古先扬, 马敏先

(1. 贵州医科大学附属口腔医院 口腔修复种植科, 贵州 贵阳, 550000;2. 贵州省贵阳市口腔医院 口腔种植科, 贵州 贵阳, 550000)

组织工程的目标是用生物相容性替代品(如生物工程组织)替代受损、损伤或缺失的身体组织，目前组织工程在修复较小缺损时有良好的应用前景，小型植入物可以利用宿主扩散的氧气和营养物质在植入后保持活力，但大型植入物会受到营养物和氧气扩散的限制，导致缺氧诱导的细胞死亡，从而导致植入失败[1-2]。氧参与维持细胞活力、生长、代谢、分化过程[3], 在无氧环境中，细胞可以通过糖酵解维持其ATP储备，然而当细胞无法进入强大的血管网络时，会导致葡萄糖储备快速消耗[4]。通常组织含氧量为2%～3%, 长期极端缺氧时细胞不能维持生物分子生成和离子梯度，可能会引发细胞功能丧失，甚至死亡，阻碍组织修复与伤口愈合[5]。在天然组织中，氧气通常只能从天然毛细血管扩散100～200 μm, 所以在>1 mm的大型非血管化支架中，细胞可获得的氧气与营养有限，难以维持移植的细胞的活力[6]。而缺损部位的血管网络生成需要数天到数周的时间，在成熟的血管网形成之前，氧气、营养物质转运障碍，这将直接影响细胞存活率及组织修复[7-8]。理想情况下，功能性组织结构必须向支架内包裹的细胞提供氧气、营养物质和生长因子，以确保细胞存活、增殖、分化并保持代谢活性。在人体中，组织营养物质的主要来源是通过血管系统的宿主血液供应[9]。目前在临床中常用的一种提高体内氧浓度的疗法为高压氧疗法(HBOT), 是将患者置于舱内，使其短时间承受较高的氧气浓度和压力的一种治疗方法，可以抑制厌氧菌的生长，缓解炎症，促进骨再生，已广泛应用于骨髓炎，受损皮肤移植物和皮瓣等[10]。但是高压氧疗法需重复给药治疗，依赖患者依从性[11]。所以需要一种在植入初期可不间断地向植入内部提供营养和氧气来降低细胞死亡率，同时兼具抗厌氧菌的作用，利于组织再生[12]。氧释放生物材料，特别是过氧化物，因其在伤口部位控制氧气生成方面具有可调节性而备受关注[13]。本文概述过氧化物在骨、胰腺、心血管等领域的研究进展。

1 过氧化物的分类

过氧化物分为固体无机过氧化物和液体过氧化物，两者均可向组织结构持续释放氧气以维持高细胞活力。将释放氧的过氧化物结合聚合物支架的方法已越来越多地用于增强组织结构的活力[14]。

常见的固体无机过氧化物为过氧化钙(CPO)、过碳酸钠(SPC)、过氧化镁(MgO2)等，与水接触发生水解可产生氧气。固体无机过氧化物接触水后，第1步会生成过氧化氢，第2步是H2O2分解成氧气[15]。液体过氧化物如过氧化氢，是一种液体化合物，在水中可快速分解成水和氧气。由于过氧化物与水接触后，突发释放可能以不受控的速率发生。为了更好地控制氧释放速率，可用疏水性材料封装释氧颗粒。例如选择疏水的高分子材料聚己内酯(PCL)封装不同浓度的CPO, 来降低植入初期CPO颗粒的分解速率[16]。

2 过氧化物在组织工程中的应用

为了达到提高局部氧浓度的效果，目前已有研究将过氧化物结合到生物材料中，形成氧释放生物材料以达到原位产氧的目的。

2.1 骨组织工程

骨缺损区缺血缺氧仍然是治疗大段骨缺损时的棘手问题。因此，近年来释氧生物材料得到了广泛的研究。HSIEH等[17]开发了CaO2+MnO2/PLGA可注射的复合产氧系统可以有效缓解低氧环境下生长的小鼠成骨前体细胞(MC3T3-E1)的缺氧反应，并促进其成骨分化[18]。ELHAM等[19]制作了2种不同内部结构(中空和实心)的左旋聚乳酸(PPLA)-CPO微球，并将过氧化氢酶接枝到微球表面，加速H2O2向氧的转化，防止H2O2的积累和细胞损伤。结果显示实心微球的氧气释放较中空结构更持久，同时将不含过氧化氢酶的PLLA-CPO微球与人脂肪间充质干细胞培养后，细胞活力下降在75%以下，过氧化氢酶接枝可以减弱对细胞的毒性。有研究采用3D打印技术制作由PCL、β-磷酸三钙(β-TCP)和MgO2组成的复合支架。O2和Mg2+可以持续释放3周左右。同时，与对照组相比，支架在缺氧条件下对骨髓间充质干细胞(BMSCs)的存活、增殖、迁移和成骨分化有明显的促进作用。影像学研究和组织学分析结果显示，植入PCL/β-TCP/MgO2支架可促进种子细胞存活，显著增加新骨形成[20]。

2.2 胰腺组织工程

1型糖尿病是一种自身免疫性疾病，可导致胰腺内β细胞的破坏[21]。目前的治疗方法是希望通过植入免疫分离的微囊化胰岛(称为生物人工胰腺)来替代丢失的β细胞团。这种方法的目标是在不需要免疫抑制剂的情况下恢复血糖调节。胰岛具有高度的代谢活性，正常功能状态下需要大量的氧气，为了防止胰岛缺氧损伤，在血管重建发生前(通常在移植后5～10 d), 需要持续供氧[22]。一种以胶原为基础的CPO低温生物支架氧气释放可持续21 d, 与单独的低温生物支架植入胰岛相比，植入到低温CPO生物支架中的胰岛具有更高的生存能力和功能，将同基因胰岛移植到糖尿病小鼠附睾脂肪垫(EFP)中，结果显示CPO生物支架可改善胰岛功能，使糖尿病小鼠恢复血糖控制[23]。此外，有研究将CPO-聚二甲基硅氧烷复合物共培养的胰岛移植到糖尿病大鼠模型中，探索补充氧合对体内细胞功能的影响。移植结果显示，与含释氧复合物共培养胰岛的移植物有效性显著改善。这些结果证明了释氧材料可减轻胰岛在培养过程中有害缺氧诱导途径激活的效力，并强调了原位产氧对产生的胰岛移植结果的重要性[24]。

2.3 心血管组织工程

血管损伤导致的缺氧是细胞治疗成功的主要限制因素，移植细胞要存活，必须有足够的营养和氧气供应。有研究通过疏水材料PCL复合CPO降低了过氧化氢浓度并延长了氧气生成的时间，原位氧张力的提高使植入细胞能够持续产生大量的血管生成因子，并提供一个代谢保护的促血管生成微环境，活组织的释氧作用也有效地协调植入组织的快速全层血管化[25]。

此外心肌梗死可引起心肌细胞、成纤维细胞和内皮细胞的大量死亡。梗死区氧含量极低是死亡的主要原因，心肌梗死还可引起严重的致病性炎症反应、瘢痕形成和心功能下降[26]。保护心脏细胞和促进心脏修复是治疗心肌梗死的关键目标[27]。通过电喷雾法制备的以PLGA为壳层、PVP/H2O2为核层的核壳结构微球与热敏水凝胶混合，能在4周内持续释放氧气。在缺氧条件下，人脐静脉内皮细胞、心脏成纤维细胞和心肌细胞分别与可释放氧气的微球-水凝胶复合系统、单纯水凝胶培养，结果显示可释放氧气的微球-水凝胶复合系统中3种细胞的存活数量显著多于单纯水凝胶组[28]。

2.4 皮肤伤口愈合

皮肤中的弹性纤维由成纤维细胞合成，参与伤口愈合。弹性蛋白来源于一种可溶性前体—原弹性蛋白，主要由纤维蛋白-1和-2组成。弹性蛋白在特定酶赖氨酰氧化酶(LOXs)作用后交联，与微纤丝结合，产生的纤维对环境压力、抗张强度和压缩具有极强的抵抗力，研究[29]表明缺氧会影响原弹性蛋白和LOX的表达，破坏愈合过程中的纤维合成弹性。为了加强皮肤伤口的愈合，一种含有SPC的PLGA薄膜在24 h内，可以观察到氧气从薄膜中释放出来。当产氧生物材料与小鼠缺血组织接触后，可观察到组织坏死和细胞凋亡减少，这表明，使用产氧生物材料可以维持数天的组织活力[30]。糖尿病创面具有多种病理生理变化，治疗难度较大。缺氧是糖尿病创面血管化不良和慢性愈合的主要原因之一。ZEHRA M等[13]以PCL为基础加入SPC研制的释氧静电纺丝创面敷料。实验结果表明，研制的敷料能够连续产氧，覆盖了PCL/SPC敷料的创面具有相对更好的血管化和愈合。

2.5 肌肉再生

临床上长时间缺血、缺氧可导致肌肉和组织坏死，而为创伤缺血后的缺氧肌肉补充氧仍然是一个重大的医学挑战，对组织抢救、修复和再生具有重要意义。LYU X G等[31]开发了丝素蛋白/角蛋白/明胶/CPO薄膜，良好的力学性能、无细胞毒性、抗菌作用，支架能够在体外2周内有稳定的氧气释放。与不含CPO的薄膜相比，含CPO的薄膜显示兔平滑肌细胞生长和活力改善。体内实验采用狗尿道缺损模型证明了CPO膜治疗动物上皮细胞层和组织肌束的形成。有研究[32]制备了含有SPC的可注射生物材料，直接注射到大鼠骨骼肌，结果显示可以部分维持缺氧条件下静止的骨骼肌稳态。

2.6 抗菌

生物材料不仅需要能够促进健康的组织整合，还需要能够同时抵抗细菌定植和由此引起的相关感染。在口腔科, 3%的过氧化氢溶液主要用于促进牙龈手术后的恢复，减少牙菌斑以及与牙周病有关的微生物水平，其抗菌机制是被催化剂(如过氧化氢酶)分解后释放氧气，在氧气存在的情况下厌氧菌存活率下降[33]。CaO2球形聚集体表现出优异的破伤风杆菌、具核梭杆菌、大肠杆菌等抗厌氧菌活性[34]。SOFOKLEOUS P等[35]将过碳酸钠与乙酰供体(四乙酰乙二胺)结合，可快速且持续地杀死耐甲氧西林金黄色葡萄球菌和耐碳青霉烯大肠杆菌。有研究采用静电纺丝技术制备了不同比例的过氧化钙(1%、5%和10%)加入或不加入抗坏血酸的PCL纳米纤维。抗菌评价证实了纳米纤维对大肠杆菌和表皮葡萄球菌生长的抑制特性[36]。ABUDULA T等[37]成功制备了由聚癸二酸甘油酯(PGS)/PCL聚合物和CPO纳米粒子组成的释氧支架，通过纸片扩散法证明该支架能有效抑制与外科感染相关的金黄色葡萄球菌活性。因此过氧化物有希望应用于抗菌感染(尤其是用于厌氧菌感染)局部生物应用。

2.7 肿瘤治疗

大多数实体肿瘤中存在低氧肿瘤细胞，会引起对辐射照射的耐药性，降低放疗效果，导致治疗失败、复发和转移[38-39]。有文献报道了一种以中空介孔二氧化硅纳米颗粒(HMSNs)为载体，在HMSNs的通道和空腔中合成SPC, 并涂覆聚丙烯酸(PAA)的氧输送功能材料。该材料诱导大量活性氧自由基产生杀死癌细胞，效果显著。同时，单独应用SPC-HMSNs-PAA时未见明显的细胞毒性[40]。化学动力学疗法(CDT), 通过芬顿或类似芬顿的反应将H2O2转化为一种剧毒的羟基自由基(OH), 以杀死癌细胞，使选择性肿瘤治疗成为可能[41]。但由于癌细胞内源性H2O2不足，其作用受到严重限制。同时，表位印迹的特异性识别在靶向癌细胞标记物方面也发挥着重要作用[42]。有研究制备了H2O2自给可降解的分子印迹聚合物(MIP)用于有效的CDT, 采用荧光过氧化钙(FCaO2)作为成像探针和H2O2来源, CD47胞外区暴露的肽作为模板，丙烯酸铜作为功能单体之一。具有识别位点的MIP可以特异性靶向CD47阳性癌细胞，实现荧光成像。在微酸性环境下，在谷胱甘肽(GSH)还原作用下, MIP被降解，暴露的FCaO2与水反应，不断产生H2O2。自供的H2O2通过MIP框架内铜离子介导的类似芬顿的催化反应产生OH, 诱导癌细胞凋亡。因此, MIP纳米平台能够特异性识别癌细胞标志物, H2O2自给和可控治疗，成功用于靶向CDT[43], 为体外精确靶向和强化治疗提供了新方法。

3 总结与展望

目前，组织工程技术研究取得很大进展，但是在修复大尺寸创伤或缺损时仍存在一些难点需解决: 组织工程支架除了必须具有一定的机械强度、良好的生物相容性和生物可降解性外，还应模拟生物微环境; 移植后如何保持细胞活性; 移植后由于血管生成和血管化不适当或不足而出现供氧不足，导致细胞凋亡和组织坏死[44-46]。充足的氧气供应对细胞生存和生长至关重要，因此开发长效释氧支架有可能克服组织工程应用中氧气供应短缺的问题。

氧释放支架的主要目标是为细胞代谢提供更好的环境，提高组织工程效果、缺血组织愈合和组织再生。有研究选择过氧化物作为产氧源，采用PCL、PLGA和GelMA等多种生物材料作为载体，制备成薄膜、微球、凝胶等形式，控制过氧化物的反应速率，延长氧气释放时间，实现氧气的持续释放，并且实验也证明了释氧支架在最初的几天和几周内可促进细胞分化和组织再生，但是观察氧气释放曲线时仍可发现在释放初期存在突释现象。所以加入过氧化氢酶或MnO2可以有效减少羟基自由基的产生，降低细胞毒性。也有研究利用过氧化物的分解产物来实现抗菌效果、抑制癌细胞。总的来说，过氧化物结合高分子生物可降解生物材料在骨再生、胰岛移植、心血管组织工程、肌肉再生、伤口愈合、抗菌和肿瘤治疗应用中得到了广泛的研究，因此氧释放生物材料对于药物输送、防止细胞死亡和组织感染，促进组织修复，具有较好的应用前景。

目前，释氧生物材料的应用范围有限，这可能是因为过氧化物分解后存在突释、难以提供长期控释，并且难以根据预期的应用将载体材料的降解速率和氧气释放曲线进行调整。因此选择合适的氧源、载体材料、释放控制方法是有助于实现临床转化的必要条件。如何制备高效的功能化的氧释放生物材料，以实现合理调控氧气释放的时间及释放量等还需解决的问题。