张倡铭，边月红，张 欣，曹永芝

(山东大学生殖医学研究中心，山东 济南 250012)

生物样本库是在知情同意前提下按照标准化程序采集、保存、使用各种人体的生命支持和代谢及其衍生物组分等信息，用于临床疾病治疗和实验室研究的科学管理系统，也叫生物银行[1]。生殖专科医院拥有丰富的生殖相关疾病临床资源，建立科学、规范、高效的专科生物样本库，能够为生殖健康致病机制的研究和诊疗新靶点的发现奠定坚实基础，从而为临床基础研究提供强力支撑。本文主要介绍了生殖专科样本库的建设经验。

1 生殖专科样本库建设概述

1.1建立质量控制体系

1.1.1建立规范的质量控制文件 样本库需要按照中国人类遗传资源办公室“人类遗传资源采集、收集、买卖、出口、出境审批”的要求申请该项认证。该认证对于加强人类遗传资源的规范化管理，有效保护和合理利用人类遗传资源提供了法律依据。按照ISO20387生物样本库国际标准和中国医药生物技术协会标准化达标文件要求，建立符合本单位的质量控制文件，涵盖质量手册、程序性文件、标准操作程序和原始记录[2]，涉及出入库、运输、分装、质量控制、销毁、安全、后勤、行政等方面[3-4]。

1.1.2完善组织构架，实现专人专岗管理 样本库应依托所在医院的学术委员会、伦理委员会，并设立专门的管理委员会。样本收集和使用前召开学术论证会，在符合国家法律要求和伦理学规范的前提下，有针对性地收集和使用样本。样本库设置固定工作人员，明确每位工作人员岗位职责，设置主任、样本管理、质量管理、信息管理和办公室等岗位，建立细化的工作量考核标准，树立为科研人员服务的工作理念。

1.1.3合理设置功能分区，完善运行设施 样本库应分为样本制备区、样本质控区、低温区、超低温区和深低温区等功能区，其中样本接收区主要完成样本接收后基本信息的采集和核对，样本处理区主要完成对样本的多级核对和各组分离，样本制备区主要完成样本的分装、核酸提取等。超低温区和深低温区最好设置在1楼或加固承重的楼层，具有备用电源。配备自动化分装、自动核酸提取和核酸质量检测等设备。样本库设置独立的门禁系统、视频监控系统、远程温度监控报警系统和独立通风装置，确保样本安全。

1.1.4加强运行权限与伦理管理 样本出入库应采用3级审批制度，根据不同管理级别设置不同权限。对样本收集实行严格的伦理学审批，每份样本附有《生物样本采集知情同意书》，保证样本的合法性，以发挥最大的科研价值[5]。

1.1.5做好信息化建设 样本库要在规范化、标准化和规模化上不断提高，需要建立完备的收集、随访、储存、信息化管理体系，实现临床信息、样本信息和科研信息的数字化管理。数据资源管理层主要由生物样本资源数据库、科研数据库、临床信息数据库、随访数据库和用户数据库组成，其功能包括但不限于：捐赠者身份信息和临床信息采集、自主调查问卷设计、病例随访、管理硬件设备、耗材及生物样本采集、处理、储存和运输等，并能够从第三方系统[医院信息系统(HIS)、检验信息系统(LIS)等]中产生相关的捐赠者数据库。建议所有样本采用二维码标识和全过程跟踪，根据工作需要持续升级信息化管理系统，并且与医院的HIS、LIS系统对接，对样本采集、样本转运、临床诊疗、样本检验、样本制备存储、样本使用、随访和设备使用等信息进行全方面管理，并结合样本使用者情况实现平台信息共享和多中心信息共享[6]。研究生离校前将样本相关科研信息全部留存样本库，逐步建立样本科研信息知识库，便于后续研究人员调阅和使用。

1.2样本的收集与处理

1.2.1临床资料信息管理 对临床汇总信息、入库信息、纸质临床资料、知情同意书、样本运输信息、样本出库信息等进行权限化分级管理，避免秩序混乱、信息泄露和样本信息使用不畅，提高样本出入库效率。知情同意书的内容和格式经过伦理小组制定并交由院伦理委员会审查，确保捐献者知情权，并充分保护捐献者隐私。

1.2.2血液样本采集与处理 采用1支抗凝血和1支自凝血(采血管无添加剂)采集血液样本，每支5 mL。抗凝血确保血液与抗凝剂充分混合，自凝血常温放置15 min后处理，2 530 r/min离心10 min。利用自动化分装设备提取血浆、血清、有核细胞层(有核细胞层分2管，血浆、血清为4管，每管0.5 mL)，将2管血浆和血清分别储存于气相液氮罐，其余储存于-80 ℃冰箱。所有血液样本采用分区备份储存[7]。

1.2.3颗粒细胞、卵泡液样本采集与处理 主要采集卵壁颗粒细胞样本及其卵泡液。壁颗粒细胞处理：采集行辅助生殖取卵术后液体，2 000 r/min离心10 min，收集上清卵泡液，每管5 mL，分2管保存至-80 ℃冰箱。沉淀后加入1 mL透明质酸酶，轻轻震荡，放入37 ℃水浴锅30 min，然后转移至15 mL离心管，加入3.5 mL淋巴细胞分离液。将水浴的混合物移入淋巴细胞分离液上层，1 600 r/min离心10 min。用一次性吸管将中层液面漂浮的颗粒细胞吸出，均分为2份，分装至RNA-free冻存管，加入磷酸盐缓冲液(PBS)，颠倒混匀，以8 000 r/min离心3 min，弃上清液，置于-80 ℃冰箱保存。

1.2.4组织样本的采集与处理 采集胎盘、脐带、卵巢、子宫内膜、附睾穿刺物、蜕膜、绒毛等样本，样本取材完成后分别置于RNAlater、液氮、4%多聚甲醛中保存。为有效保证样本质量，组织离体到有效保存所用时间不得超过30 min[8]。

1.2.5尿液样本的采集与处理 所收取的尿液样本有晨尿、随机尿、计时尿(一般为24 h)、中段尿，尿量为15 mL。采集后使用带底部二维码的冻存管分装，并根据信息系统分配的位置冻存于-80 ℃冰箱中。部分实验室采取硝酸纤维膜真空抽滤的方式对尿液内细胞和蛋白成分进行膜上保存，具体操作如下：将尿液以3 600 r/min离心10 min，取上清液按照2∶1比例与PBS混匀,然后经0.2 μm的磷酸纤维膜真空抽滤后吹干，于无菌袋中抽真空保存[9]。

1.2.6核酸样本的制备 基因组DNA提取的方法有很多种，如酚-氯仿法、异硫氰酸胍法、固相吸附法、高盐沉淀法和碘化物法等[10]。RNA提取主要为Trizol法和磁珠法[11]。检测RNA样本浓度、纯度和完整性，以二维码标记后入库。DNA样本储存于-80 ℃冰箱，RNA样本保存于液氮中。在避免样本反复冻融前提下，每半年进行1次核酸抽样质检，抽检比例不低于1/100，并生成质控报告。

1.3样本的质控 (1)血液样本的质控：血液样本以核酸质控为主，以OD260 nm/OD280 nm,OD260 nm/OD230 nm比值检测核酸的纯度，采用分光光度计定量检测核酸的浓度，采用安捷伦4200检测核酸的完整性。(2)组织样本的质控：组织样本在冷缺血30 min内迅速分装和转移至液氮中是保证样本质量的必要条件，其可以有效地避免RNA及其蛋白质的降解。如后续实验涉及RNA分析，应将离体组织迅速转移到RNAlater中保存。样本库通过苏木素-伊红染色对组织样本的形态学进行评估。提取RNA检测其浓度、纯度和完整性，并进行荧光定量分析。(3)尿液样本的质控：目前，关于尿液样本的质控报道较少见。多数样本库主要采取-80 ℃保存方法，但随着保存时间的延长，尿液样本的酸碱度、小分子物质会发生改变或消失。有研究报道，在-80、-20、4、20 ℃条件下保存的样本经过0、4、8、24 h后，尿液样本中不同种类的氨基酸(丝氨酸、缬氨酸、精氨酸、亮氨酸)浓度会受到影响，其中-80 ℃保存效果最佳[12]。另外，反复冻融对尿液样本代谢产物浓度会构成影响，因此在尿液样本保存过程中，应尽量以-80 ℃保存，并减少反复冻融次数。(4)样本信息质控：样本库每季度对所存样本信息进行抽样，对样本所存位置是否准确、患者信息是否完整、随访信息是否完整、知情同意书是否完备、条码是否完整、虚拟位置与实体位置是否一致等信息进行检查。(5)样本库的第三方质控：生物样本库应积极开展国内、国际第三方质控，以保证样本质量。

2 生殖专科样本库建设存在的问题及建议

2.1存在的问题 因患者回访率高等因素，样本数量持续增加，造成储存空间不足。生物样本库建设中仍然需要从人才、资金、技术方面提供支持，需要政府和各参与方引起重视，保障其可持续发展[13]。生物样本库的发展需要标准化和规范化，其高度依赖信息化建设，离不开多中心联盟和资源共享，需多学科融合支撑[14]。生殖样本收集涉及科室较多，各收集环节衔接沟通需要样本库执行委员会统一协调。不设置妇产科的生殖专科医院，样本收取存在非本院本地等情况。因此，采集及运输过程需要加强监管，保证取材、处理和运输的质量，做到宁缺毋滥。

2.2建议

2.2.1科学的样本质量控制是关键 影响样本质量的因素非常多，而样本质量直接关系到科研数据的准确性，因此加强生物样本库标准化建设显得至关重要。近年来，国内和国际的样本库标准化组织不断对样本收集过程中的规范化和标准化进行完善[15]。目前，我国尚未建立国家层面的生物样本库，因此应更好地根据国情建立适应人民需要及适应经济发展的生物样本库[16]。从事样本库建设的工作人员应该不断学习，完善样本收取流程，使样本库更科学、更贴近于临床和科研需求。

2.2.2信息库整合是样本库质量控制的纽带 信息库建设是保证生物样本质量、信息注释和样本应用的纽带。生物样本库发展已从“以样本为中心”转变为“以数据为中心”，最终形成综合性生物信息资源平台，这样才能够更好地为科学研究服务，便于研究人员探讨生物样本所涉及的医学伦理、临床沟通及社会问题[17]。未来生物样本库的内涵建设更需要聚焦于样本本身的科学研究,即样本科学[18]。通过大样本的关联分析，打造生命科学研究发展和国际合作的基础平台，实现样本库的质量管理、信息数据结构化与标准化数据共享，建立临床信息、样本信息、随访信息和科研信息相关联的信息化系统平台，为预测疾病的发生、发展与转归提供强力支撑。

3 小 结

生物样本库是为转化医学、药物研发提供强力支持的新型学科。近年来，我国专科生物样本库发展迅速，但是仍然有许多瓶颈需要突破。完整、全流程的质量控制体系，可保证样本质量。本文概述了生殖专科样本库建设过程，从生物样本实体库规范采集、储存、质控和出库等环节，以及临床信息、样本信息、科研信息和随访信息等要素的整合方面进行了讨论，并探讨了生殖专科样本库建设中存在的问题及应对策略，希望为该学科生物样本库的建设提供参考。