陈绍文

(湖北中医药大学基础医学院 湖北 武汉 430065)

脑溢血(ICH)指原发性脑实质出血(SICH)，约占所有卒中的10%-15%，发病率约为0.01-0.03%，即每100000人中可能有10-30人发生脑溢血，发病率非常高[1]。在所有卒中类型中，脑溢血的死亡率也最高，30天死亡率达30%-50%。脑出血的长期预后也不容乐观，约有75%的脑出血患者1年后留下严重的残疾或死亡，可见脑出血具有高发病率，高致残率，高死亡率，其危害十分大，给病人带来沉重的负担[2]。{Keep, 2012 #4;Asch, 2010 #5}因此探究脑溢血的发病机制和寻求干预此疾病的药物显得尤为重要。现有老中医惯用大黄治疗脑溢血效果明显，同时周德融[3]对2000年以来采用活血化瘀法为主治疗脑出血急性期的临床报道38篇统计，其中大黄的使用频率最高。因此开发大黄，研究大黄干预脑溢血的作用，将为脑溢血病人带来新的希望。

大黄药用历史悠久，始载于《神农本草经》，是在中药组方中应用范围最大、使用频率最高的为数不多的几种重要中药之一，也已作为一种世界性药物载人19个国家的药典中。现在医学研究表明，大黄能显著改善危重症患者各项凝血功能指标，纠正凝血功能紊乱，改善凝血功能。目前研究表明大黄其活血化瘀作用可能是通过调节维持血管形态的NO,ET-1以及参与血液微循环的PGI2 ,VWF的水平而达到的。[5]但目前对于大黄治疗脑溢血的机制尚不清楚，对于大黄治疗脑溢血的机制的研究缺乏整体系统的方法。

因此，应用网络药理学分析方法，从整体出发，构建不同层次复杂网络，分析、预测脑溢血发病机制和大黄的治疗作用机制，以期发现大黄干预脑溢血的作用靶点和信号通路，为探究大黄治疗脑溢血的机制寻求思路和方向，从而扩大其药用范围，指导中药大黄的临床应用。

1 材料与方法

1.1 脑溢血相关蛋白质靶点的收集

应用DisGeNET在线数据库提供的多种信息，包括17074个基因与20370种疾病、失调、性状及临床或异常人类表型之间的561119个基因-疾病关联(GDA)，及83002个SNP与9169个疾病和表型之间的135588个变异-疾病关联(VDA)。以“cerebral hemorrhage”为关键词在此数据库中进行搜索，收集与脑溢血相关的基因,。

1.2 脑溢血相关蛋白质的互作网络构建

利用STRING 10.0数据库提供的蛋白质之间直接和间接相互作用的排序信息，将TTD中收集到的与脑溢血相关的蛋白质名称输入，进行检索，选取得分高于0.7的高置信度蛋白质互作信息，得到脑溢血相关蛋白质的蛋白互作数据，这些数据再导入生物信息分析软件Cytoscape 3.7.1 ，构建脑溢血相关的蛋白质互作(PPI)网络，实现可视化浏览和分析。STRING 10.0数据库是一个储存已知的和预测的蛋白质相互作用的数据库，并对每一对蛋白互作信息进行评分，得分越高则说明蛋白质相互作用信息的置信度越高；Cytoscape是一种开源的生物信息分析软件，用于构建蛋白质、基因、药物等相互作用构成的分子交互网络[3]。

1.3 大黄活性成分的收集

通过中药系统药理学分析(TCMSP)平台，检索大黄的所有化学成分，以口服利用度≥30%、类药性 ≥0.18 作为参数，筛选活性成分，导出这些活性成分的三维化学结构数据。

1.4 大黄潜在靶蛋白的预测

将上述所得的活性成分三维化学结构数据分别上传至SwissTargetPrediction平台进行预测，得到化学小分子潜在靶点和生物活性结果。鉴于所得的药物靶点蛋白质存在命名不规范的问题，应用UniProt数据库中的，获得活性成分潜在靶蛋白的信息。该信息导入软件Cytoscape 3.7.1中，构建活性成分-预测靶点网络。

1.5 网络合并

利用软件Cytoscape 3.7.1中，将脑溢血的PPI网络与大黄活性成分-预测靶点网络进行合并，构建大黄活性成分-潜在靶点网络，以便系统分析大黄治疗脑溢血的潜在作用靶点。

1.6 靶点-通路富集分析

为说明大黄治疗脑溢血的潜在作用靶点在信号通路中的作用，对大黄活性成分-潜在靶点网络中的各蛋白在David v 6.7数据库[6-8]平台上进行KEGG的生物通路富集分析，所得的KEGG通路富集分析的信号通路信息导入Cytoscape 3.7.1软件，构建靶点-通路网络。

2 结果

2.1 脑溢血相关的PPI网络

在DisGeNET数据库中，检索到66个与脑溢血相关的一级蛋白，经STRING 10.0数据库检索，得到60个与一级蛋白互作的脑溢血相关二级蛋白。这些一级蛋白、二级蛋白信息经Cytoscape 3.7.1软件被构建成脑溢血相关的PPI网络，包含60个脑溢血相关蛋白质和155条脑溢血相关蛋白质的相互作用关系。

2.2 大黄活性成分-预测靶点网络

在TCMSP平台检索出的大黄化学成分中，以OB≥30%、DL≥0.18 作为参数进行筛选，得到16个活性成分及其三维化学结构基本信息。这些活性成分的基本信息具体见表2，相应的三维化学结构信息经SwissTargetPrediction平台、UniProt数据库及Cytoscape 3.7.1软件拟构，得到大黄活性成分-预测靶点网络,包括240条活性成分-预测靶点联系、16个化合物节点和119个靶点节点。

2.3 与脑溢血相关的大黄活性成分-潜在靶点网络

脑溢血相关的PPI网络与大黄活性成分-预测靶点网络由Cytoscape 3.6.1软件进行合并，删除其中没有交集的蛋白，得到直观的大黄活性成分治疗脑溢血的潜在靶点。结果显示，脑溢血相关的大黄活性成分-潜在靶点网络中靶点Degree的平均值为2.8，有7个靶点蛋白质的Degree≥2，提示这些蛋白质很可能是大黄活性成分发挥作用的潜在靶点。

2.4 KEGG通路富集分析

应用DAVID平台，对脑溢血相关的大黄活性成分-潜在靶点网络中25个靶点蛋白在信号通路中的作用进行分析研究，得到29条信号通路，其中P<0.01的信号通路有15条涉及人类疾病、环境信息处理、细胞过程与组织系统信号通路。其中，人类疾病信号通路为10条信号转导通路有3条；细胞过程信号通路有1条，免疫系统信号通路为1条。

3 讨论

脑溢血相关的PPI网络包含了60个脑溢血相关蛋白质和155条脑溢血相关蛋白质的相互作用关系，说明脑溢血是一种多蛋白相互作用的复杂疾病。在大黄活性成分-预测靶点网络中，有240条活性成分-预测靶点联系、16个化合物节点和119个靶点节点，可知一种化学成分可作用多个靶点，一个靶点同时也受多种化学成分作用，充分体现了中药多成分、多靶点的特色。由图3可知，大黄治疗脑溢血的潜在活性成分有11个，潜靶点有25 个，即ESR1、MMP2、CASP3、MMP9、IL6、IL1B、APP、F7、VEGFA、BCL2、MMP3、PTGS2、CRP、TIMP2、F10、SERPINC1、APOB、PLAT、APOE、FLT1、HMOX1、BAX、PRKCQ、BCL2L1、ADD1，说明大黄干预脑溢血是通过多成分，多靶点来发挥作用的。其中雌激素受体-1(ESR1)、基质金属蛋白酶-2(MMP2)、人半胱氨酸蛋白酶-3(CASP3)、基质金属蛋白酶-9(MMP9)、白介素-6(IL6)、白细胞介素-1β(IL1B)、β-淀粉样前体蛋白(APP)、的degree值大于2，说明这些基因与脑溢血的发作有很大的相关性。图四为与脑溢血相关的大黄潜在靶点富集通路，得到29 条通路，其中P<0.01的有15条，表明大黄干预脑溢血可能是参与了这些通路的调控。其中基质金属蛋白酶-2 (MMP2)和基质金属蛋白酶-9 ( MMP9)是脑内最重要的基质金属蛋白酶。相关研究证实，其在脑卒中发病后表达量明显升高，能够通过降解细胞外基质成分，进而破坏血脑屏障，引发并加重脑水肿的发生。[6],[7]IL-6是具有广泛生物活性的细胞因子，在炎性反应、抗感染及损伤等过程中发挥多种生物学作用，具有免疫调节作用，可以促进B细胞的增生分化和抗体分泌;诱导细胞因子的表达，如:PDGF，FBGF，MCSF等;其它作用:极性相反应、抗瘤效应等。有报道它与血管性疾病及动脉粥样硬化的进展密切相关，其作用的重要机制是IL-6直接促进血管平滑肌细胞的增殖以及单核细胞趋化因子1的释放。[8]而ESR1的遗传多态性可能有助于脑溢血的发展，尤其是女性脑溢血患者。并且脑内ESR1的多态性可作为脑梗死的潜在生物标志。[9]同样有研究称CASP3可能成为判断脑溢血出现或着脑溢血严厉程度的潜在生物标志。综上，本研究基于网络药理学，预测了大黄治疗脑溢血可能的16个化合物及25个干预脑溢血的潜在作用靶点，初步阐述了大黄干预脑溢血的可能通路，为进一步开发大黄对于脑溢血的治疗提供参考。