陈肖霖 赵巧素 许丰

肝癌是全世界范围内最常见的消化系统恶性肿瘤之一，根据世界卫生组织GLOBOCAN 2018年全球癌症统计报告分析：肝癌在新发癌症病例中占4.7%，居第六位；在死亡癌症病例中占8.2%，居第四位[1]。肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是原发性肝癌的主要形式，占原发性肝癌的75%～85%[1]。近年来研究发现，昼夜节律的慢性扰动与代谢疾病和癌症（包括肝癌）风险增加有关[2]。此外，目前已知的肝癌高危因素可以破坏昼夜节律[3]。Period（PER）基因是核心昼夜节律基因之一，它的异常表达已被证明与包括肝癌在内的癌症发生和发展有关[3-4]。因此，了解PER在肝癌的作用机制以寻求新的治疗靶点具有十分重要的意义。本文就PER与肝癌的关系以及其在肝癌发生、发展中的作用机制作一综述。

1 昼夜节律与Period基因

昼夜节律，又称生物钟，也被叫作生物节律，广泛存在于自然界的各种生物中，是一种生命适应外界条件和环境周期变化从而演化来的内在时钟机制[2]。昼夜节律是由昼夜节律基因的近24 h的振荡表达周期形成的，昼夜节律基因的表达产物形成复杂的转录翻译反馈回路,并通过下游一系列靶基因实现对细胞的生长、代谢、衰老、凋亡等生命活动的调控[4]。哺乳动物的昼夜节律来自位于视交叉上核（suprachiasmatic nucleus，SCN）的主时钟，它驱动外周时钟并通过昼夜节律输入路径与环境信号同步[5]。昼夜节律可以产生独立于外部因素的振荡行为[6]。尽管外周时钟有一定的自主性，但通过SCN进行协调是协调外周时钟之间的网络所必需的[7]。

目前已鉴定出至少15个核心昼夜节律基因：PER1、PER2、PER3、CLOCK、CRY1、CRY2、ARNTL/BMAL1、TIMLE SS/TIM、RORA、RORB、RORC、NPAS2、NR1D1、NR1D2和CSNK1E/CKIε。其中一些基因构成转录-翻译反馈回路。基本的螺旋-环-螺旋异二聚体转录因子（CLOCK/BMAL1和BMAL1/NPAS2）以负反馈方式（CRY1、CRY2、PER1、PER2 和 PER3）调节基因表达[4]。

PER是核心昼夜节律基因之一。上世纪的科学家们在研究果蝇的X染色体时发现PER基因突变会影响果蝇的昼夜节律，随后发现人类也有PER基因，且有 3 种基因型：PER1、PER2、PER3，在 SCN、脑和外周组织中均有表达，是哺乳动物生命活动中的分子中心节律振荡器和外周节律振荡器的重要元件[8]。以往研究表明，PER在胃癌、结直肠癌、肝细胞癌、胰腺癌、前列腺癌、乳腺癌、头颈部鳞状细胞癌、慢性淋巴细胞白血病等中的表达水平发生显著变化[8-13]，并且PER基因的异常表达与癌症患者的生存时间有关[10]。

2 昼夜节律与肝癌

越来越多的证据表明，昼夜节律基因在癌症的发生、发展中起着非常重要作用：维持增殖信号，逃避生长抑制因子，抵抗细胞死亡，使复制永生，诱导血管生成，激活侵袭和转移，以及能量代谢重新编程。通过各种因素破坏昼夜节律稳态，不仅与癌症发病率增加有关，也是人类癌症发展的一个重要的独立危险因素[4]。

慢性肝炎病毒感染、接触致癌物等高危因素会破坏肝脏的昼夜节律，诱导或促进肝癌的发生、发展[3]。研究发现，乙型肝炎病毒感染的HCC组织中的生物钟指数低于正常组织[14]。在体外实验中发现乙型肝炎病毒X蛋白会破坏HCC昼夜节律基因的表达平衡[15]。Benegiamo等[16]发现丙型肝炎病毒可调节肝时钟基因机制，昼夜节律蛋白PER2可抑制病毒复制。此外，慢性时差不仅会促进二乙基亚硝胺(diethylnitrosamine，DEN)诱导的肿瘤生长，还会引发多种肝脏肿瘤类型，例如胆管癌、肉瘤、混合肿瘤和较大的肿瘤[2]。值得注意的是，DEN本身具有破坏小鼠休息活动和体温的昼夜节律的能力[17]。上述发现表明，昼夜节律基因的表达改变可以由肝炎病毒、致癌物等致癌因素诱导，而昼夜节律紊乱本身也是肝癌的重要危险因素。因此，肝脏昼夜节律紊乱会促进肝癌的发生、发展，而肝癌反过来也会破坏昼夜节律时钟系统。

有研究表明，PER在多种癌症中出现异常表达，与癌症的进展、预后相关，其在癌症发生、发展过程中的作用存在争议。部分研究发现HCC组织中PER的mRNA和蛋白表达水平均低于其配对癌旁组织[15，18]。李波等[19]对117例HCC组织蜡块进行免疫组化发现PER2蛋白表达不仅低于癌旁组织，还与HCC患者的肿瘤直径、门脉侵袭、TNM分期以及预后相关。在细胞实验中，PER2蛋白过表达，能使细胞增殖受抑制、细胞凋亡水平增加。这些似乎都表明PER蛋白对肝癌有抑制作用。但是，最近的研究发现肝癌的肿瘤微环境（tumormicroenvironment，TME）的PER基因缺失可抑制肿瘤生长和转移性定植[20]。同时，另一项研究表明，在敲除组蛋白H2A变体macroH2A1的人肝癌细胞株中，PER1的mRNA和蛋白表达增加，而沉默PER1基因可部分缓解macroH2A1缺失引起的恶性表型[21]。可见PER基因和蛋白不一定具有抑癌作用。此外，赵巧素等[22]发现肝癌细胞株 MHCC97L、HepG2、SMMC7721、HHCC中PER2的蛋白及mRNA表达水平高于人正常肝细胞L-02，PER2的mRNA和蛋白过表达后，肝癌细胞株的Warburg效应增强，细胞活力、转移及侵袭能力上调。同样，PER2蛋白过表达可在低氧条件下增强参与癌症生长、转移、耐药等过程的缺氧诱导因子1（hypoxia-inducible factor 1，HIF-1）活性[23]。因此，PER的mRNA和蛋白表达参与肝癌的发生、发展，但其具体机制仍不清楚，需要进一步研究。

3 Period基因在肝癌发生、发展中的作用机制

3.1 基因遗传变异 单核苷酸多态性（single-nucleotide polymorphism，SNP）是个体之间最常见的遗传变异，昼夜节律基因的遗传变异与癌症患者的易感性和预后密切相关[24-25]。近年来有学者提出昼夜节律基因的SNP可作为潜在的预后生物标志物。PER3基因中的一个功能性SNP（rs2640908）与HCC患者的总生存率显著相关[26]。同样，Zhang等[27]根据HCC患者昼夜节律基因中的功能性SNP基因分型，发现PER家族中有3个SNP与 HCC患者的总生存期（overall survival，OS）显著相关，其中PER1的rs3027178、PER3的rs228729与无复发生存期(recurrence free survival，RFS)显著相关。可见，PER基因的遗传变异与肝癌易感性和预后相关，而其机制可能是通过SNP的位置改变基因表达。SNP位于不同的基因体中，包括启动子、外显子、内含子以及5'-和3'UTR。SNP的位置可能通过改变启动子活性、结合转录因子以及DNA-CpG位点甲基化来影响基因表达[24]。例如：PER3的rs228729位于转录因子结合区，可影响mRNA的表达；PER1的rs3027178、PER3的rs228669和rs2640908位于外显子剪接增强子区，影响mRNA的序列[27]。

3.2 表观遗传修饰 HCC中基因表达的改变通常是由DNA、RNA和组蛋白中发生的表观遗传修饰引起的[28-29]。这些表观遗传变化也是HCC的潜在预后标志物[28]。

DNA甲基化模式的改变是HCC发生、发展的关键因素，对肝癌的诊断和预后具有潜在价值[30]。在大多数肿瘤中，PER等核心时钟基因的表达水平被更高水平的DNA甲基化所下调[14]。此外，在PER1、PER2和PER3的转录本中发现了mRNA中最普遍的内部修饰位点，即 N6-甲基腺苷（N6-methyladenosine，m6A）位点[31]。m6A关键酶之一的甲基转移酶16（methyltransferase like 16，METTL16）的缺失或低表达与HCC患者较差的总生存期（OS）、无病生存期（disease free survival，DFS）相关，该酶在HCC中表达下调可能与多种代谢途径的激活有关[32]。同样是m6A关键酶的烷烃羟化酶同源体 5（alkB homolog 5，ALKBH5）在 HCC 组织中表达也下调，并与HCC患者的存活率低有关，这可能是由于ALKBH5在体内和体外均能抑制HCC细胞的增殖和侵袭[33]。最新的研究发现ALKBH5以m6A依赖性方式增加PER1 mRNA的表达来预防胰腺癌的进展[34]。这种机制在HCC中可能也有发生。甲基转移酶3（methyltransferase like 3，METTL3）、YT521-B 同源结构域家族蛋白2（YT521-B homology domain family proteins，YTHDF2）等m6A相关因子与HCC患者的不良预后相关[35]，被认为是HCC进展的关键因素[36]。敲除METTL3可延迟昼夜节律RNA加工，从而控制基因的表达速度[31]。

组蛋白的表观遗传修饰对昼夜节律基因的转录振荡至关重要。混合谱系白血病3（mixed lineage leukemia 3，MLL3）是与HCC发病机制相关的突变基因[37]，它编码的组蛋白甲基转移酶失活会影响包括PER2在内的昼夜节律基因启动子的振荡[3]。组蛋白乙酰转移酶p300/CBP是HCC中糖酵解相关代谢酶的关键表观遗传调节因子，p300/CBP抑制剂B029-2能降低糖酵解功能和核苷酸合成来部分抑制HCC进展[38]。在小鼠实验中，CBP是伏隔核壳区中Per1表达的上游调节因子[39]，反义诱导的Per1、Per2、NPAS2基因敲除能调节CBP的表达[40]。此外，p300通过调节PER1、PER2基因的启动子处的组蛋白H3乙酰化，与这些基因的转录一起沉淀[3]。SIRT1是一种NAD（+）依赖性蛋白去乙酰酶，抑制其活性可以促进TP53的稳定性，从而抑制HCC进展[41]。SIRT1能使PER2去乙酰化，从而调节昼夜节律基因的表达[42]。

这些发现都说明了昼夜节律基因PER表观遗传控制的表达改变在HCC进展中起重要作用。

3.3 与细胞周期相互作用、调控细胞凋亡 研究表明，昼夜节律基因PER与细胞周期相互作用、调控细胞凋亡，从而影响肝癌的发生发展。

细胞周期的每个阶段都有可能受到生物钟的影响。肿瘤抑制蛋白p53的不稳定会通过影响细胞周期促进肝癌的发生[43]。PER1通过与共济失调毛细血管扩张症突变（ataxia-telangiectasia-mutated，ATM）和检查点 2（checkpoint 2，CHK2）相互作用，激活和增强 p53稳定性，从而抑制G1-S转换，导致细胞周期停滞，防止有受损DNA的后代转化为癌细胞[4]。有趣的是，细胞周期调节机制也会影响昼夜节律基因的表达。正如所观察到的，p53是耦合昼夜节律和细胞周期振荡器的核心。部分研究发现p53能抑制PER1、PER2的转录表达，从而破坏CLOCK/BMAL1调节并改变昼夜节律[4，44]。此外，生物钟调节器早幼粒细胞白血病（promyelocytic leukaemia，PML）蛋白能介导 PER2 和 BMAL1的结合，并促进PER2核定位，从而调节昼夜节律[45]。昼夜节律-细胞周期串扰对肿瘤风险的总体影响是复杂的，它可能有助于昼夜节律紊乱对肝癌发展的影响。未来的研究需要将这些分子观察与昼夜节律紊乱介导的癌症风险联系起来。

大量证据显示生物钟与DNA损伤反应（DNA damage response，DDR）明确相关，而DDR会导致癌症表型[4]。PER1与ATM/CHK2结合以响应辐射诱导的双链断裂（double-strand break，DSB），停止细胞周期进程并触发p53介导的细胞凋亡[46]。有研究发现PER2表达水平与细胞凋亡相关基因有关，当PER2表达低时，用顺铂处理的癌细胞DNA损伤会增强并有更高的细胞凋亡率[47]。

3.4 调节肿瘤微环境 肿瘤微环境（tumormicroenvironment，TME）是指肿瘤或癌症干细胞存在的细胞环境[48]，其中有肿瘤细胞、免疫细胞、基质细胞、内皮细胞和癌症相关的成纤维细胞[49]。TME的变化可以调节代谢、免疫、分泌和功能，从而抑制或促进肿瘤的进展[48，50]。目前越来越多的研究证明，昼夜节律紊乱可以导致肿瘤免疫微环境重塑，从而促进肿瘤细胞增殖[51]。癌症细胞或癌症干细胞中的时钟部件（包括昼夜时钟和时钟基因/蛋白）可以调节可溶性因子的表达和分泌，这些可溶性因子包括缺氧诱导因子1α（hypoxiainducible factor 1α，HIF-1α）、芳香烃受体核转位因子（aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator，ARNT）、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、嗅质蛋白样 3（olfactomedin-like 3，OLFML3）等，它们能调节TME的生物学功能[20]。此外，TME时钟部件可以影响干细胞特性、肿瘤生长和转移。例如，TME中的PER1和PER2基因可促成转移前微环境、诱导化疗耐药和免疫抑制，从而促进肿瘤的转移生长[20]。在小鼠实验中发现基质中PER2基因的缺失会抑制原发性肿瘤的生长[52]。同样，Liang等[53]通过生信分析发现TIMELESS、CRY2、PER1和RORA基因的表达水平与HCC的预后有关，并参与了细胞周期、PI3K/AKT通路和脂肪酸代谢。同时，他们还发现这四种核心生物钟基因与抑制肿瘤生长的B细胞和通过控制炎症微环境以抑制肿瘤发展的调节性T（regulatory T，nTreg）细胞有密切关联。由此可见，包括PER在内的生物钟基因可以通过改变TME从而影响肿瘤的发生、发展。

3.5 调节肝脏代谢 肝脏是控制全身稳态的中枢代谢器官，昼夜节律在肝脏稳态中起主要作用，包括肝脏的葡萄糖、胆汁酸、脂质和胆固醇的代谢。事实上，超过50%的肝脏代谢物具有与时钟基因转录相结合的昼夜节律[54]。目前研究发现，慢性昼夜节律紊乱诱导神经内分泌功能障碍，引起耦合的外周时钟紊乱、全基因组基因失调、致癌激活和肝脏中的全局代谢功能障碍[55]。

越来越多的HCC确诊病例被认为与昼夜节律紊乱、肥胖和非酒精性脂肪性肝病（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）有关[56]。NAFLD 是一种代谢性疾病，因此，影响肝脏代谢的PER基因可以参与HCC的发展。有研究发现PER1的转录参与促进脂质合成的过程[57]，还能影响胰高血糖素依赖性葡萄糖的产生[58]。昼夜节律紊乱通过交感神经系统功能障碍和胆汁淤积激活组成型醛固酮受体（constitutive aldosterone receptor，CAR），而这种过度表达的CAR可以促进肝脏肿瘤，从而推动从NAFLD发展为非酒精性脂肪性肝炎（non-alcoholic steatohepatitis，NASH），并最终发展为 HCC[55]。

除了营养代谢外，肝脏还有解毒功能，主要依靠细胞色素 P450（cytochromes P450，CYP）进行药物、毒物代谢。在PER1基因缺陷的小鼠中，四氯化碳（carbon tetrachloride，CCl4）、辣椒素、对乙酰氨基酚等毒素的代谢率下降，并且因CCl4引起的肝损伤和肝纤维化可明显减轻，这表明PER1蛋白通过增加细胞色素P450 2E1（cytochrome P450 2E1，Cyp2e1）的表达促进肝脏中毒素的代谢[59]。另一项研究表明PER2也可通过调节Cyp2e1的表达参与乙酰氨基酚的生物代谢[60]。此外，Chen等[61]证明PER2蛋白通过抑制其阻遏物REV-ERBα，从而正向调节小鼠肝脏中CYP2B10的表达和活性。可见，肝脏的解毒代谢功能也受到昼夜节律基因PER家族的调节。

因此，PER家族通过调节肝脏的多种代谢在肝癌中发挥作用。

4 小结与展望

PER基因参与调控昼夜节律，而昼夜节律紊乱会对肝脏分子钟和宿主昼夜节律系统产生负面影响，从而增加癌症风险和进展。可见，维持正常的昼夜节律可作为肝癌等疾病的预防战略。虽然不少研究发现PER基因参与肝癌的生长、侵袭转移等过程，但PER基因在其中发挥作用的确切分子机制仍不清楚，需要进一步探索。通过PER基因对肝癌发生、发展作用机制的深入研究，可能会为改进临床治疗方案、寻找新靶点和预后标志物提供了新思路。