郝彩琴 李 军 陈海燕 冷晓红

宁夏职业技术学院生命科技学院，宁夏银川 750002

柴胡为大宗中药材，收载于2020 版《中华人民共和国药典》中的柴胡为伞形科植物柴胡Bupleurum chinense DC.或狭叶柴胡Bupleurum scorzonerifolium Willd.的干燥根[1]。柴胡的入药部位是根，主要含柴胡皂苷类、黄酮类、植物甾醇，以及少量挥发油、多糖等有效成分，主要的药理活性为抗炎抗菌、抗病毒、解热、镇痛、镇咳、增强免疫力、保肝利胆及抗肿瘤等[2]。柴胡地上部分也含有黄酮类、少量皂苷类、木脂素类、香豆素类等成分[3-4]，有研究表明，柴胡地上部分的主要成分是黄酮类化合物，且含量高于地下部分[5-7]。黄酮类化合物是中药的有效成分之一，其具有抑菌、抗氧化、抗衰老、提高免疫力、抗肿瘤、降糖等多种生物活性[8-11]。柴胡药材在宁夏六盘山地区已基本形成规模化种植，柴胡地上部分是中药材柴胡的非药用部位，占柴胡整个植物干重的70%～85%，目前大部分被当成废料而丢弃从而造成极其严重的资源浪费[12]。因此，本研究采用4 因素3 水平的正交实验对宁夏栽培柴胡地上部分总黄酮的提取工艺进行优化并对其抑菌活性进行研究，为充分利用资源、扩大药用部位提供理论依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

TYS-400A 型粉碎机（浙江省永康市红太阳机电有限公司）；RE-52A 型旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂），SIB-Ⅲ型循环式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司）；TU-1810 型紫外可见分光光度计（北京普析公司）；EL204 型万分之一电子天平（梅特勒-托利多仪器）；DHG-9123A 型电热恒温培养箱（上海一恒科技有限公司）；SHY-2A 型水浴恒温振荡器（常州国宇制造）；YJ-875 型超净工作台（苏州安泰）；YXQLS-50S 型立式压力蒸汽灭菌器 （上海博讯实业公司）；96 孔培养板（康宁3599 型）。

1.2 试药

对照品芦丁来自中国食品药品检定研究院，批号：100080-201409；无水乙醇、氢氧化钠、亚硝酸钠、硝酸铝均为分析纯，无水乙醇购自西安化学试剂厂，批号：20181028；氢氧化钠购自烟台市双双化工有限公司，批号：20181218；亚硝酸钠购自上海广诺化学仪器有限公司，批号：20140616；硝酸铝购自上海广诺化学仪器有限公司，批号：20141111；食用乙醇；蛋白胨和牛肉膏均购自北京奥博星公司；柴胡地上部分（2016年9月采自宁夏隆德县柴胡种植基地，经高级农艺师张守宗老师鉴定为北柴胡地上部分，符合2020 版中国药典标准[1]），低温晾干，粉碎过2 号药典筛。

1.3 菌株

大肠埃希菌（ATCC25922），鼠伤寒沙门氏菌（ATCC14028），表皮葡萄球菌（ATCC12228），福氏志贺菌（CMC C51572）均为宁夏医科大学临床医学院检验中心馈赠，合轴马拉色菌（CBS9593）、球形马拉色菌（CBS9597）、糠秕马拉色菌（CBS1878）、钝形马拉色菌（CBS7876）均购自中国医学科学院皮肤病研究所。

2 方法与结果

2.1 总黄酮的含量测定

2.1.1 对照溶液的制备 精密称取对照品芦丁10.5 mg，以30%乙醇溶解，并转移至50 ml 的容量瓶中定容至刻度，得到芦丁标准液的质量浓度为0.210 mg/ml，放4℃冰箱备用。

2.1.2 标准曲线的绘制 对文献[13-14]中的方法略有改动，精密吸取芦丁对照品溶液0、0.4、0.8、1.4、2.0 和2.6 ml 分别置于10 ml 容量瓶，用移液枪加入5%的NaNO2溶液0.4 ml，静置6 min，再加入10%的Al（NO3）3溶液0.4 ml，静置6 min，然后再加入4%的NaOH溶液4 ml，用30%的乙醇定容至刻度，静置10 min，以试剂空白为参比，用1 cm 比色皿测定510 nm 波长处的吸光度，并以芦丁浓度（C，mg/ml）为横坐标，吸光度（A）为纵坐标，制作如图1的标准曲线，得回归方程为：A=11.69×C+0.000 7，R2=1。在0～0.054 6 mg/ml 的范围内芦丁乙醇溶液线性关系良好。

图1 标准曲线图

2.2 总黄酮的提取

根据单因素实验的结果，选定55%乙醇为溶剂[15]，静态回流方法进行提取，以料液比（A）、浸泡时间（B）、提取次数（C）、提取时间（D）为4 个考察因素，每个因素分3 个水平，以总黄酮含量为考察指标，利用正交实验设计软件对实验数据进行分析，得到实验结果，确定柴胡地上部分总黄酮的最佳提取工艺。因素、水平见表1。

表1 柴胡地上部分黄酮提取工艺条件的正交试验设计因素与水平

准确称取柴胡地上部分粗粉1.00 g，根据表1正交设计工艺条件进行提取，减压抽滤，滤液减压低温浓缩成干浸膏，然后用30%乙醇溶解转移至50 ml 容量瓶中并定容至刻度，摇匀，每个条件平行做3 次。

2.3 总黄酮提取率测定

精密吸取按表1正交工艺设计条件提取的提取液适量，至10 ml 容量瓶中，按照“2.1.2”方法操作，依次加入显色剂，最后用30%乙醇定容，摇匀，测定吸光度，将每个条件3 次提取液测得的吸光度计算平均吸光度值，再根据标准曲线方程式计算样品溶液中总黄酮浓度C，然后代入以下公式计算总黄酮的提取率（%）：总黄酮提取率（%）=（C×N×V×10-3/M）×100。C：黄酮的质量浓度（mg/ml）；N：稀释倍数；M：提取用柴胡地上部分的质量（g），V：粗提液的定容体积（ml）。

2.4 正交实验结果

2.4.1 正交实验结果 由表2可以看出正交试验中，影响柴胡地上部分总黄酮提取率的主要因素是提取次数（C），其次是料液比（A），最后是提取时间（D）和浸泡时间（B），对于A 因素，由于k2＞k3＞k1，所以A 因素取第二水平，同理，B 因素取第一水平，C 因素取第三水平，D 因素取第一水平。表3方差分析表明，料液比、浸泡时间、提取次数、提取时间各水平间均无明显差异。因此，通过本试验可以得出，用55%浓度乙醇作为提取溶剂选用静态回流提取法提取宁夏栽培柴胡地上部分总黄酮的最佳提取工艺为A2B1C3D1，即药材用量和溶剂用量之比为1∶10，浸泡适宜时间为60 min，提取3 次，每次提取72 min，该工艺条件下总黄酮的提取率最好。

表2 柴胡地上部分总黄酮提取工艺条件的正交试验设计及其结果

表3 正交试验方差分析表

2.4.2 正交实验结果验证 精密称取柴胡地上部分粗粉1.00 g，共3 份，根据最佳工艺提取条件平行操作，各提取液低温减压浓缩成干浸膏，30%乙醇溶解、转移并定容至50 ml 容量瓶中，取适量于10 ml 容量瓶中，按“2.3”项下方法测定3 份柴胡地上部分总黄酮提取率，结果表明，验证试验的3 次平行操作中，总黄酮平均提取率为2.702%，且RSD 为1.227%，表明该工艺所选结果是合理、可行的。

2.5 抑菌活性测定及结果

2.5.1 抑菌活性测定 本研究通过测定最小抑菌浓度（minimal inhibitory concentration，MIC）考察柴胡地上部分提取物的抑菌活性，具体过程利用96 孔板参考文献[16-17]方法并略有改动，向96 孔板1～9 号孔，每孔加入空白营养肉汤培养基90 μl，再向每排的第一孔中加入质量浓度为500 mg/ml 的柴胡地上部分提取物，然后对样品液依次进行2 倍稀释后向每孔中加入菌落浓度为1.0×106CFU/L 的不同受试菌悬液20 μl，此时每孔样品液最终质量浓度依次为： 250、125、62.5、31.25、15.63、7.815、3.908、1.954、0.977 mg/ml，并在10 号孔加入180 μl 培养基和20 μl 菌悬液作阴性对照，11 号孔加入200 μl 培养基作空白对照，12 号孔加入100 μl 培养基和100 μl 药液作空白对照，然后置37℃培养箱中恒温培养16 h 后取出观察。如小孔内澄清即为完全抑制细菌生长，而澄清小孔中所对应的最低药物浓度即待测样品对该菌的最低抑菌浓度。氨苄青霉素钠（细菌的阳性对照）和特比萘酚（真菌的阳性对照）阳性对照的做法同样品，但初始浓度为0.050 mg/ml。每个样品重复3 次。

2.5.2 抑菌活性测定结果 利用微量稀释96 孔板，测定柴胡地上部分提取物对4 个细菌和4 个真菌的最小抑菌浓度，柴胡地上部分提取物对供试的4 种细菌和4 种真菌都有一定的抑菌活性，但与阳性对照相比较总体的抑菌活性较低（表4）。

表4 柴胡地上部分提取物的最小抑菌浓度

3 讨论

本实验过程中正交条件的乙醇浓度、提取方法等都是通过单因素实验而确定，具体见参考文献[15]，为了使提取工艺更接近工业化生产，本研究在选择料液比时最高比例设为1∶10，提取次数最多选择提取3次。单宇等[18]对北柴胡茎叶总黄酮最佳提取工艺的研究表明，75%乙醇10 倍量60℃提取2 h，确定提取级数为2 次，总黄酮提取率达2.871%；马文兵等[19]对北柴胡茎叶总黄酮的最佳提取工艺为，用70%的乙醇在80℃下，按料液比1∶30，回流提取2 h，其总黄酮提取率为3.40%。本研究最佳提取工艺是，用55%的乙醇作溶剂，按料液比1∶10，浸泡时间60 min，加热回流提取3 次，每次提取72 min，提取率是2.70%，与马文兵等[19]、单宇等[18]的研究结果接近，但文献用70%、75%乙醇作溶剂进行提取，使提取液色素含量较多，影响总黄酮含量的紫外测定，而本实验在研究过程中采用55%乙醇浓度作为提取溶剂，所得提取液色素较少，同时可以节约溶剂乙醇的用量，更有利于工业化生产。

在本研究最佳工艺提取下，柴胡地上部分总黄酮的抑菌活性研究表明，柴胡地上部分总黄酮具有一定的抑菌作用，这与王红燕等[20]研究显示柴胡地上部分不同醇提物抑菌活性的初步研究结果基本一致，与阳性对照结果相比，柴胡地上部分总黄酮对四种供试的马拉色菌抑制作用更强。本研究仅对其粗提物的抑菌活性进行了测定，对于纯化后总黄酮的抑菌活性及抑菌机制还有待进一步研究。另外，本研究在提取之前对药材进行预浸泡，使溶剂更好地扩散进入细胞内容，更有利于有效成分的提取和溶出，同时，可以节约提取时间。