钟选芳 周 潇 张丽科

1.广东省惠州市第一人民医院消化内科，广东惠州 516000；2.广东省惠州市第一人民医院检验科，广东惠州 516000

炎症性肠病 （inflammatory bowel disease，IBD）是一组病因不明的主要累及胃肠道的慢性炎症性疾病，包括溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）和克罗恩病（Crohn's disease，CD），近年来发病率呈上升趋势，但诊断和鉴别诊断较难，需结合临床、内镜、影像、病理等综合分析[1]。文献报道血清学标志物可帮助诊断和鉴别诊断IBD[2-3]。近年来国内外对抗中性粒细胞胞浆抗体 （anti-neutrophil cytoplasmic antibody，ANCA）相关抗体与IBD 的关系报道不同中心的研究结论不甚一致，各抗体在IBD 中的临床意义尚不明确，与临床表型的关系报道尚有争议[4-7]。本研究探讨单独和联合检测血清核周型ANCA（perinuclear-ANCA，p-ANCA）、胞浆型ANCA（cytoplasmic-ANCA，c-ANCA）、蛋白酶3-ANCA（proteinase 3-ANCA，PR3-ANCA）、髓过氧化物酶-ANCA（myeloperoxidase-ANCA，MPO-ANCA）4种ANCA 相关抗体在IBD 诊断、鉴别诊断的临床意义，探讨抗体水平与IBD 疾病表型和临床特征的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2018年5月至2021年2月在惠州市第一人民医院收治的123 例IBD 患者作为研究对象，按照疾病类型分为UC 组（78 例）与CD 组（45 例），选取同期收治的非IBD 肠道疾病患者56 例作为疾病对照组（其中肠结核8 例，肠白塞病2 例，肠易激综合征7例，嗜酸性胃肠炎1 例，缺血性肠病13 例，非特异性肠炎19 例，孤立性直肠溃疡2 例，过敏性紫癜4 例），选取同期在健康体检中心体检的30 名健康体检者作为正常对照组。UC 组中，男46 例，女32 例；年龄18～58岁，平均（46.1±13.7）岁；CD 组中，男31 例，女14 例；年龄16～49 岁，平均（33.9±13.4）岁；疾病对照组中，男32例，女24 例；年龄14～62 岁，平均（45.9±15.7）岁。正常对照组中，男19 名，女11 名；年龄18～64 岁，平均（42.1±13.9）岁。四组研究对象的一般资料比较，差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。纳入标准：①UC 组和CD 组患者均符合《炎症性肠病诊断与治疗的共识意见（2012，广州）》的相关诊断标准[8]；②UC 组与CD 组患者均为初次诊断，并且在未进行治疗之前纳入本研究，本研究中的4 种抗体检测均在患者治疗之前进行；③患者精神状态良好，能够配合研究中的各项检查的进行。排除标准：①未定型结肠炎；②伴有自身免疫系统疾病、遗传性疾病的患者；③确诊各种恶性肿瘤包括实体瘤与血液系统肿瘤的患者；④患者正在进行免疫调节，免疫抑制治疗；⑤患者伴有严重的血液系统疾病，凝血功能障碍等；⑥伴有精神疾病，无法配合研究进行的患者。所有患者均签署知情同意书；本研究严格遵守伦理学标准要求，并通过惠州市第一人民医院医学伦理委员会审核批准（批号2019044）。

1.2 抗体检测

所有研究对象均采用间接免疫荧光法（IIF 法）检测血清p-ANCA、c-ANCA 的表达水平，采用酶联免疫法（ELISA 法）检测血清PR3-ANCA、MPO-ANCA 的表达水平。试剂由美国宙斯（Zeus）公司提供，操作步骤如下。①加样：分别取稀释过的阴性对照、阳性对照、校正品和血清样品100 μl 加入到对应的反应孔中，取100 μl 样本稀释液加入到对应孔中作为试剂空白对照；②温育：温度为室温（20～25℃），时间（25±5）min；③洗板5 次；④加入酶联物：每孔中加入酶联物100 μl；⑤温育：温度为室温（20～25℃），时间（25±5）min；⑥洗板5 次；⑦加入显色液（TMB）：每孔中加入TMB 100 μl；⑧温育：温度为室温（20～25℃），时间10～15 min；⑨加入终止液：每孔加入终止液50 μl 以终止反应；⑩读数：在加入终止液30 min 内，将微孔板置于450 nm波长下读取每个孔的光密度值，以空白试剂作对照。

1.3 观察指标及评价标准

①四组患者的血清p-ANCA、c-ANCA、PR3-ANCA、MPO-ANCA 的检测阳性率以及4 种抗体联合检测（即任一抗体阳性即为阳性）的检测阳性率；②p-ANCA、c-ANCA、PR3-ANCA、MPO-ANCA 单独使用以及4 种抗体联合使用的诊断敏感度、特异度、准确度、阳性预测值，阴性预测值。敏感度=真阳性/（真阳性＋假阴性）×100%；特异度=真阴性/（假阳性＋真阴性）×100%；准确度=（真阳性＋真阴性）/总例数×100%；阳性预测值=真阳性/（真阳性＋假阳性）×100%，阴性预测值=真阴性/（真阴性＋假阴性）×100%；③4 种血清学抗体对UC 和CD 鉴别诊断的效能；④不同临床特征的UC 患者的p-ANCA 表达情况。

1.4 统计学方法

采用SPSS 26.0 统计学软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，以P＜0.05 为差异有统计学意义；计数资料采用率表示，组间整体比较采用χ2检验，两两比较采用Bonferroni 方法校正，检验水准α=原α 水平/比较次数，即0.05/6=0.008。

2 结果

2.1 各组患者血清p-ANCA、c-ANCA、PR3-ANCA、MPO-ANCA 的表达情况

四土组患者的p-ANCA、c-ANCA、PR3-ANCA、MPO-ANCA 及4 种抗体联合检测的阳性率比较，差异有统计学意义（P＜0.01）。UC 组患者的p-ANCA 高于CD 组、疾病对照组、正常对照组，c-ANCA、PR3-ANCA、联合检测高于疾病对照组、正常对照组，MPOANCA 高于疾病对照组，差异有统计学意义（P＜0.008）。CD 组的c-ANCA 及联合检测高于疾病对照组、正常对照组，MPO-ANCA 高于疾病对照组，差异有统计学意义（P＜0.008）。其余各指标组间两两比较，差异无统计学意义（P＞0.008）（表1）。

表1 各组患者p-ANCA、c-ANCA、PR3-ANCA、MPO-ANCA 的表达情况[n（%）]

2.2 血清学抗体诊断IBD 的效能

4 种抗体联合检测诊断IBD 的敏感度和准确度最高，分别为66.7%、75.1%；PR3-ANCA 和MPOANCA 的特异度最高，均为95.3%。4 种抗体及联合检测的敏感度和准确度比较，差异有统计学意义（P＜0.05），而特异度比较差异无统计学意义（P＞0.05）。P-ANCA、c-ANCA、PR3-ANCA、MPO-ANCA 的阳性预测值分别为91.2%、89.9%、87.9%、88.9%、88.2%；阴性预测值分别为53.3%、60.0%、46.6%、47.4%、64.7%。

4 种抗体单独检测诊断IBD 的特异度均较高（90.1%～95.3%）。提示用于鉴别诊断价值较高，但敏感度均不高，单独检测中c-ANCA 的敏感度最高，但也仅为57.7%，独立作为筛查指标的价值可能有限。4种抗体联合检测的敏感度比单独检测高，但特异度有所下降，提示联合检测抗体比单独检测可能更有利于IBD 的筛查和诊断（表2）。

表2 4 种抗体及联合检测对IBD 的诊断效能[%（n/N）]

2.3 血清学抗体对UC 和CD 鉴别诊断的效能

表1结果显示，其他抗体对CD 诊断意义不大，效能较低，且数据量较大，故仅列出诊断价值较高的4 项，见表3。PR3-ANCA 诊断UC 的特异度最高，但敏感度仅为26.9%，p-ANCA 诊断UC 的效能较好，四项联合检测能提高诊断UC 的敏感度，但特异度有所下降，c-ANCA 诊断CD 的敏感度和特异度均不高，鉴别诊断效能较低。

表3 4 种抗体在UC 与CD 鉴别诊断中的效能[%（n/N）]

2.4 p-ANCA 与UC 患者临床特征的关系

选择诊断效能最好的p-ANCA 进行分析，比较不同临床特征UC 患者的p-ANCA 检测结果，结果显示，p-ANCA 在中重度UC 患者中阳性率高于轻度UC 患者，病变部位在广泛结肠的患者占比高于其他部位，差异有统计学意义（P＜0.05）（表4）。

表4 不同临床特征的UC 患者的p-ANCA 表达情况[n（%）]

3 讨论

IBD 的病因以及发病机制目前尚未明确，但是通过大量研究表明IBD 的发病与免疫功能失衡有关。免疫抗体多数可以作为血清学检测指标对疾病诊断起到辅助作用，并且血清学标志物无创，技术要求并不高，检测简单方便，可以量化，因此在疾病的检查诊断以及严重程度分层中都获得了广泛应用[9]。IBD 无明确的诊断金标准，并且疾病的早期诊断，疾病的严重程度分级，疾病治疗效果的评估，预后评估，复发评估等都缺乏具有良好临床诊断价值的量化指标，具有良好敏感度以及特异度的血清学标志物可以满足IBD的诊断以及评估需求[10]。目前IBD 的血清学标志物众多，其中自身抗体抗ANCA 研究最为广泛，但是各种不同分型的ANCA 抗体在IBD 患者中的具体表达情况，以及诊断效能在众多研究中结论不一[11]。本研究目的是探讨单独和联合检测ANCA 相关4 种血清学自身抗体p-ANCA、c-ANCA、PR3-ANCA、MPO-ANCA 在IBD 诊断、鉴别诊断的临床意义，探讨抗体水平与IBD 临床特征的关系。本研究结果显示，UC 组患者的p-ANCA、c-ANCA、PR3-ANCA、4 种抗体联合检测的表达阳性率高于疾病对照组以及正常对照组，CD组患者的p-ANCA、c-ANCA、4 种抗体联合检测的表达阳性率高于疾病对照组以及正常对照组，UC 组和CD 组患者的MPO-ANCA 的阳性率均高于疾病对照组（P＜0.008），而疾病对照组与正常对照组的p-ANCA、c-ANCA、PR3-ANCA、MPO-ANCA 的表达情况均无明显统计学差异（P＞0.008）。与其他肠道疾病患者以及健康正常患者相比，IBD 患者具有明显的p-ANCA、c-ANCA、PR3-ANCA、MPO-ANCA 表达改变，提示IBD 患者可能存在ANCA 相关的自身免疫抗体表达异常，与何淳等[12]的报道结果相似。

本研究中p-ANCA、c-ANCA、PR3-ANCA、MPOANCA 4 种抗体单独检测诊断IBD 的特异度均较高（90.1%～95.3%），但敏感度均不高，提示用于鉴别诊断价值较高，但独立作为筛查指标的价值可能有限，4种抗体联合检测的敏感度比单独检测高，但特异度有所下降，提示联合检测抗体比单独检测可能更有利于IBD 的筛查和诊断，与van Schaik 等[13]的研究报道一致，其研究提示联合血清标志物诊断IBD 的预测值比单一血清标志物高。国内傅苏娜等[14]的研究也提示联合多种血清学标志物有助于IBD 的诊断。Smids 等[15]报道血清学标志物可以鉴别诊断UC 和CD，Arias-Loste 等[16]报道PR3-ANCA 在血清学标志物中更普遍，滴度在UC 患者比CD 患者更高，ROC 曲线范围为0.81，敏感度和特异度分别为52.1%和97.3%，提示PR3-ANCA 可能是一个有助于鉴别诊断IBD 的血清学标志物。本研究中PR3-ANCA 诊断UC 的特异度最高，达82.2%，提示PR3-ANCA 可能有助于鉴别诊断UC 和CD。本研究中UC 患者的p-ANCA 与CD 患者的表达具有明显差异，并且在UC 与CD 的鉴别诊断中具有较好的敏感度与特异度，具有较好的鉴别诊断效能，可以用于UC 与CD 的鉴别诊断，与文献报道结果一致。文献报道UC 患者中p-ANCA 的敏感度和特异度分别是44%和86%，阳性预测值和阴性预测值分别为78%和58%，提示p-ANCA 对于鉴别UC 和CD是一个有利的参数[17]。国内一项meta 分析显示ANCA诊断UC 的敏感度和特异度分别约51%和92%，最佳敏感度和特异度位置为0.727[18]。

关于血清学抗体与IBD 临床特征的关系报道也很多，本研究分析了不同临床特征的UC 患者中p-ANCA 的表达情况发现，p-ANCA 在中重度UC 患者中阳性率高于轻度UC 患者，病变部位在广泛结肠的患者占比高于其他部位，差异有统计学意义（P＜0.05），表明在不同严重程度，不同病变部位的UC 患者中p-ANCA 表达具有明显差异，提示p-ANCA 的表达与UC 的严重程度、病变部位可能相关，p-ANCA 的表达可能有助于评估UC 病情，与Wang 等[10]的报道一致，他们比较了41 例UC 患者、71 例CD 患者、71 例其他胃肠道疾病患者和31 例正常健康对照者，结果发现p-ANCA 在中重度活动性UC 阳性率比轻度活动性UC 高。但我国袁柏思等[19]研究结果表明p-ANCA 与UC 患者的诊断年龄、病变位置、治疗方式均无关，总之，ANCA 相关抗体在IBD 的临床意义值得进一步探讨。本研究样本量较少，观察指标较少，并且未根据疾病严重程度分级进行分组，因此本研究结论也有一定的局限性，未来可以加大样本量，根据疾病分层对血清学标志物进行进一步的研究。

综上所述，p-ANCA、c-ANCA、PR3-ANCA、MPOANCA 在IBD 中的表达与非IBD 患者具有明显差异，4 种抗体联合检测对IBD 诊断效能更好，p-ANCA 对UC 的病情评估可能具有一定的辅助价值，值得在临床推广使用。