候吉超，吴 斌，姜 蕾，宋晶晶，任小娜，王 东

（喀什大学 生命与地理科学学院，新疆帕米尔高原生物资源与生态重点实验室，新疆喀什 844000）

随着世界人口的高速增长，“全球粮食危机”已经成为全世界关注的焦点，而转基因技术的诞生为解决“全球粮食危机”带来了希望[1-2]。与传统食品不同，转基因食品是利用基因工程技术将外源基因导入植物体内并使其表达，通过对其加工后形成供人类食用或饮用的物质，包括加工食品、半成品和未加工食品，但不包括烟草或用于药品的物质，而导入的外源基因通常来自于其他的生物体，包括动物、植物和微生物[3-4]。随着转基因作物种类的增加及其产品的大规模商业化，人们对转基因产品的安全性产生一定的质疑，监管部门、企事业单位、科研单位和消费者对转基因检测技术提出更高的要 求[5-6]。因此，建立高通量、便捷、高效的转基因检测方法对促进我国食品安全检测的发展以及完善转基因标识管理制度等方面意义重大。

目前，国内外对转基因食品的检测主要是基于外源蛋白靶标和外源核酸成分，相继建立了一系列快速、灵敏的转基因食品定性、定量检测技术，如酶联免疫吸附技术（Enzyme-linked Immunosorbent Assay，ELISA）、聚 合 酶 链 式 反 应（Polymerase Chain Reaction，PCR）技术等[7]。本文对转基因食品检测技术的原理、优缺点、研究进展及发展方向进行简要概述，以期为我国转基因食品检测技术体系的发展提供参考依据。

1 外源基因的检测技术

基于外源基因的转基因食品检测技术主要以PCR为主，它利用聚合酶链式反应将外源基因在体外进行扩增，通过是否扩增出外源基因对转基因食品进行检测。常见的基于外源核酸成分的转基因检测技术主要包括多重PCR检测技术[8]、荧光定量PCR检测技术[9]、等温扩增技术[10]和基因芯片技术[11]等。

1.1 多重PCR检测技术

多重PCR（Multiplex PCR）又称复合PCR，是在常规PCR基础上发展而来的。多重PCR是指在同一个PCR反应体系中加入多对特异性引物，可以同时扩增出多个目的基因片段。与常规PCR相比，该技术是多个扩增反应同时进行，各个扩增反应在扩增过程中存在相互竞争，一定程度上降低了假阳性出现的概率[12]；同时各个扩增反应之间会相互竞争Taq DNA聚合酶，扩增效率相对较低的反应将会受到抑制，添加适量浓度的Taq DNA聚合酶可以有效地减弱抑制作用[13]。多重PCR具有高效性，对多个品系的转基因成分进行检测时，同一PCR反应体系中可以同时扩增出多个不同的目的基因，因此在检测通量和成本控制方面具有明显优势，且节省时间和试剂[14]。潘志文等[15]对转基因抗病番木瓜品系Event55-1、GM YK、华农1号共3个转基因番木瓜品系的序列进行分析，成功建立了转基因木瓜多重PCR方法，并利用不同的转基因木瓜品系对该方法进行验证，但该方法各个反应条件仍需要进一步优化，否则易使特异性和灵敏度降低。

1.2 荧光定量PCR检测技术

随着世界各国对转基因相关产品标识制度的逐步建立和不断完善，一些国家明确规定了转基因成分的最低含量阈值，如韩国为3%，巴西为1%，欧盟为0.9%等[16-17]。因此，需要建立和开发新的转基因产品定量检测技术。实时荧光定量PCR技术是将荧光染料和PCR结合，利用实时荧光信号变化监测靶基因扩增的整个过程，根据建立的标准曲线以及Ct值对目的基因进行定量分析，实现了PCR从定性分析到定量分析的飞跃。与常规PCR技术相比，实时荧光定量PCR技术具有污染少、定量准确、实时监测和自动化程度高等优点[18]，但该方法对引物设计要求高且设备仪器昂贵，需专业操作人员操作。目前，荧光定量PCR已被广泛应用于转基因产品检测。根据荧光定量PCR的化学发光原理，可将荧光定量PCR分为TaqMan探针法与SYBR Green染料法[19]两大类。邵彪等[20]以CaMV 35S启动子、NOS终止子以及标记基因NPTⅡ特异片段序列为靶基因，利用多重PCR和荧光定量PCR的特点，成功建立了多重荧光定量PCR方法，成功在肉制品中检测到植物源性转基因成分：CaMV 35S启动子、NOS终止子以及标记基因NPTⅡ。该方法灵敏度高达1 pg、重复性好且与单重PCR体系的检测结果一致。

1.3 等温扩增技术

等温扩增技术是近年来新发展起来的核酸恒温扩增检测技术。该技术是在恒温条件下，利用不同活性的酶和特异性引物对目的基因进行扩增的技术。与常规PCR相比，该类检测技术具有灵敏度高、特异性强、等温高效、操作简单和设备要求低等优势，具有良好的应用前景[21-22]。由于该方法灵敏度高，操作时容易形成气溶胶污染且对引物的设计要求比较高。常见等温扩增技术包括环介导等温扩增（Loopmediated Isothermal Amplification，LAMP）[23]、 链替代等温扩增（Strand Displacement Amplification，SDA）[24]、单引物等温扩增（Single Primer Isothermal Amplification，SPIA）[25]、滚 环 等 温 扩 增（Rolling Circle Amplification，RCA）[26]以 及 跨 越 式 滚 环等 温 扩 增（Saltatory Rolling Circle Amplification，SRCA）[27]等。目前，环介导等温扩增技术已在一定范围内得到应用，其他新发展起来的等温扩增技术还在不断完善中。YU等[28]将LAMP技术和TaqMan探针相结合，建立了一种新的LAMP-TaqMan检测方法，该方法在65 ℃恒温下，20 min内可扩增出目的DNA，可检测到至少5个拷贝的靶序列，该方法具有类似于TaqMan qPCR的高特异性，且检测速度比TaqMan qPCR快，为食品中转基因成分的快速检测提供了一种新的技术。

1.4 基因芯片技术

基因芯片技术是近年来快速发展起来的分子生物学高新技术，是基于核酸杂交的一项高通量检测技术。该技术利用固体基质表面上特定探针与标记的样品进行杂交，通过分析杂交信号强度，能够准确地对样品中不同种类的DNA序列进行定性、定量的检测[29]。基因芯片的出现解决了传统核酸印记杂交技术，如Southern Blotting和Northern Blotting等存在的操作繁杂、自动化程度低、操作序列数量少和检测效率低等不足的问题[30]。而且，通过设计不同的探针阵列、使用特定的分析方法可使该技术具有多种不同的应用价值，如基因表达谱测定、实变检测、多态性分析、基因组文库作图及杂交测序等，目前该技术已被广泛应用于转基因检测等许多领域[31]。TURKEC等[32]针对12个转基因品种（3个大豆和9个玉米）开发出一套基因芯片检测方法，该方法能够特异性地识别每个品种，且灵敏度高。基因芯片技术具有高通量、灵敏度高、特异性强等优点，但由于其成本较高、制作基因芯片技术复杂、背景干扰严重等问题，一定程度上影响了该技术的广泛应用。

2 基于外源蛋白的检测技术

基于外源蛋白的转基因食品检测技术主要以免疫分析技术为基础建立，利用转基因作物产生的特定的外源蛋白与抗体的免疫反应从而对外源蛋白进行定性和定量的分析。常见的基于外源蛋白靶标的转基因食品检测技术包括酶联免疫吸附技术（ELISA）[33]、蛋白免疫印迹（Western blot）检测技术[34]、胶体金试纸条技术和蛋白质芯片技术[35]等。

2.1 酶联免疫吸附技术

酶联免疫吸附法（ELISA）是将可溶性的抗原或抗体固定到ELISA酶标板上，保持其免疫活性，同时利用抗原抗体特异性结合反应与酶对底物高效催化反应相结合，通过酶催化产生的颜色深浅进行定性和定量分析检测[36-37]。目前，该方法已被广泛用于转基因作物及其相关产品的定性和定量分析。常见的ELISA方法主要以双抗夹心ELISA为主，该方法灵敏度高、特异性强、高通量以及定量准确，是目前商品化检测试剂盒采用的主要方法之一[38]。GUERTLER等[39]利用双抗体夹心ELISA实现了对转基因玉米中Cry1Ab蛋白的检测，最低检测限为 0.4 ng/mL。但该方法操作步骤烦琐，需要频繁地洗涤孵育，检测时间达3～4 h。JIANG等[40]对ELISA方法进行改良，通过制备初级抗体-次级抗体复合物（Ab-Ab复合物）建立了一步ELISA方法。相对于传统的ELISA，该方法不仅可以提高检测灵敏度，而且简化了操作步骤，极大地缩短了检测时间，为开发蛋白质快速检测方法提供了新的方向。

2.2 Western Blot检测技术

Western Blot检测技术是定性、定量检测蛋白表达的一种经典实验方法，其原理是利用蛋白质凝胶电泳在电场力的作用下使蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶上逐步分离，并转移到固相载体（如硝酸纤维素膜或聚偏二氟乙烯膜上），使膜上的蛋白质与相应的抗体发生免疫反应形成抗原-抗体复合物，然后与酶标记的二抗反应，通过显色反应对转基因食品中外源蛋白进行检测[41]。该技术将电泳的高分辨能力与抗原抗体免疫反应的特异性相结合，可以定性和定量地检测转基因作物和食品中的外源蛋白质。TIAN等[42]建立了一种Western Blot方法，该方法可以快速、灵敏地检测转基因饲料产品中的外源蛋白，检测限为0.5%。WANG等[43]利用Western Blot技术成功检测到外源EPSPS蛋白在转基因烟草叶片中的完整表达。但是该方法操作步骤烦琐，检测周期长，需要专业的技术操作及设备，适用于实验室检测，不适用于快速检测和商品化检测[5]。

2.3 胶体金试纸条技术

胶体金试纸条检测法是利用胶体金免疫层析技术研制而成，该技术是以免疫渗滤技术为基础建立的一种快速简易的免疫学检测技术，可用于间接定性或半定量的检测[44]。胶体金在碱性环境中带负电荷，并与蛋白质分子的正电荷产生静电吸引，从而牢固结合，以硝酸纤维素膜为载体，利用了微孔膜的毛细血管作用，使滴加在膜一端的液体缓慢向另一端渗透转移，通过抗原抗体结合，并利用胶体金呈现颜色反应，检测外源蛋白[45-46]。SANTOS等[47]研究开发了一种试纸条，它可以同时检测Cry1Ac和Cry8Ka5杀虫蛋白，检出限为0.06 μg。目前，胶体金免疫层析试纸条技术已被应用于食品各领域，如利用胶体金免疫层析试纸条技术检测食品中的污染物[48]、非法添加剂[49]、食源性致病菌[50]、食品中农药残留[51]及食品中重金属污染[52]等。胶体金试纸条法具有快速、简便、灵敏度高及较低基质效应等特点，个人可以独立完成，判定方法简单，适合于单个样品检测和非专业人士使用，且不需要其他设备，操作简单，可立即得到检测结果，适用于社会防疫、现场检测等方面[53]。但该方法易受待测样品中杂质的干扰，导致假阴性的出现，同时该方法对配对金标抗体特异性要求极高，制作复杂，时间成本高[54]。

2.4 蛋白质芯片技术

蛋白芯片技术又称蛋白质微阵列，是一种高通量的蛋白功能分析技术，可用于蛋白质表达谱分析，研究蛋白质与蛋白质的相互作用[55]。与基因芯片类似，蛋白质芯片利用化学和物理方法对固相载体进行处理，再将已知的蛋白固定在载体上形成蛋白质探针，如酶、抗原、抗体等，捕获能与之特异性结合的转基因蛋白，最后用专用计算机进行定性、定量分析[56]。汪琳等[57]建立了抗体蛋白芯片检测方法，可同时检测3种转基因成分。蛋白质芯片技术有着快速、高通量、特异性强及检测效率高的优点，能将多个、不连续的检测过程转变为一个连续、快速的检测分析过程，极大地节省了时间、试剂以及劳动量，在未来食品科学和检测领域具有广阔的发展前景，但该方法也存在蛋白芯片成本高、固相载体的选择易导致杂蛋白的非特异性吸附以及灵敏度低等问题。

3 展望

随着转基因作物迅速推广及扩大种植，转基因食品的安全性成为人们关注的焦点，现有的常规转基因检测方法都存在一些局限性，如通量低、检测时间长、成本高及需要特殊的仪器设备等，已不能满足对转基因食品快速、灵敏、高通量的检测。因此建立一种快速检测转基因食品的检测技术极为重要。

目前，商品化转基因检测试剂盒中基于蛋白检测的ELISA定性、定量检测试剂盒与试纸条检测深受科研人员的青睐，相比于核酸检测试剂盒，PCR检测对检测环境要求高、易污染，且步骤烦琐，而ELISA试剂盒与试纸条对检测环境要求低，操作相对简单。试纸条在检测时速度快，使用方便，但其在进行批量检测时成本较高，而ELISA试剂盒由于其高通量、较高灵敏度、特异性强、重复性好、可进行定量和半定量测定等优点已被广泛应用。候吉超等[5]对双抗夹心ELISA方法进行改良，利用方阵法筛选出识别不同抗原表位的单抗并进行配对，同时对工作条件进行优化，整个检测过程仅需2步，减少了一抗、二抗的孵育和烦琐的洗涤过程，简化了操作步骤，将检测时间缩短至30 min内，极大地节约了检测成本。

目前，转基因作物及食品的检测方法主要以蛋白检测和核酸检测为主，但由于蛋白质在加工过程中受高温高压及酸碱的作用，蛋白质结构易改变，易丧失抗原性，因此蛋白质检测方法适用于转基因初产品，而基于PCR技术的检测方法因具有检测范围广、特异性好、灵敏度高等优点而被广泛使用，但由于其对引物设计、操作环境、检测设备要求高，使其使用受到一定限制。因此，在检测过程中，应根据检测环境、检测性质、操作方式和仪器设备等选择合适的检测方法。不同的检测技术都有其各自的优缺点，为了快速准确地对转基因作物及食品进行检测，可以利用不同检测技术的特点，将不同的检测技术相结合，最大限度地提高检测效率和准确率，实现对转基因产品的快速定量检测，因此开发联合检测技术是一个新的方向。

随着人们对食品安全的关注度的提高以及转基因检测技术的发展，转基因食品检测趋于自动化、信息化，转基因检测技术将不仅仅局限于科学研究和实验室检测，为了方便更多的家庭及非专业人士可以快速分辨出食物中是否含有转基因成分，开发出高效、快速、便捷、高通量、低成本，且无需特殊的检测设备适合非专业人士的检测方法，将成为今后转基因检测技术研究的发展趋势。